Les microglies dérivées des iPS représentent une source biologiquement pertinente de microglies humaines pour l’expérimentation in vitro et constituent un outil important pour étudier la biologie de la microglie dans la santé et la maladie. Nous présentons un protocole simple de différenciation de la microglie qui nécessite une utilisation minimale des facteurs de croissance et permet d’atteindre une pureté et un rendement élevés. En outre, nous démontrons un test de phagocytose entièrement humanisé.
Les cellules de type microglie dérivées de l’iPSC sont très sensibles à l’évaporation du milieu. Vous devez éviter d’utiliser les puits dans le coin de la plaque de culture cellulaire et remplir tous les puits vides avec de l’eau pour améliorer la survie. Une fois que les cellules souches pluripotentes induites, ou CSPi, ont atteint 80% de confluence, dissocier les colonies en les lavant avec un millilitre de DPBS et en ajoutant un millilitre de réactif de dissociation pendant deux minutes à 37 degrés Celsius.
Délogez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules en grattant plusieurs fois pour créer une suspension à une seule cellule. Récupérez la suspension et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de DPBS. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois g pendant une minute, retirez le surnageant et remettez en suspension dans un millilitre du milieu du corps embryoïde, ou EB.
Prenez 10 microlitres de cellules et diluez-en un à deux avec du bleu de trypan. Comptez les cellules sur un hémocytomètre et, en fonction du nombre de cellules, diluez le stock cellulaire jusqu’à une dilution finale de 10 000 cellules par 100 microlitres. Pour les cellules de placage, ajouter 100 microlitres de cellules diluées par puits dans une plaque à fond rond à fond rond à faible adhérence de 96 puits.
Centrifuger la plaque à 125 fois g pendant trois minutes et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre jours. Le deuxième jour, à l’aide d’une pipette multicanal, remplacez l’ancien milieu demi-EB par un nouveau milieu. Pour générer des précurseurs primitifs de macrophages, ou PMP, recouvrez les puits d’une plaque à six puits en ajoutant un millilitre de solution de revêtement Matrigel glacée.
Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures, ou toute la nuit. Le quatrième jour de différenciation EB, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, transférer les EB dans les puits revêtus de Matrigel. Pipeter de haut en bas pour déloger les EB du puits.
Tenez ensuite la plaque inclinée pour permettre aux EB de s’installer au bord du puits. Une fois que tous les EB se sont installés, pipeter doucement et remplacer l’ancien milieu, tout en maintenant l’EB au bord du puits avec trois millilitres de milieu complet PMP fraîchement préparé. Répartir uniformément les cellules dans les puits en mélangeant manuellement la plaque d’un côté à l’autre et de l’arrière vers l’avant.
Incuber ensuite la plaque pendant sept jours pour permettre aux EB de se fixer au fond du puits. Après sept jours, inspectez les EB au microscope à champ lumineux à un grossissement quatre fois supérieur pour vous assurer qu’ils sont fixés au fond des puits. Effectuez un demi-changement moyen et, le jour 21, remplacez le milieu complet par trois millilitres de milieu complet PMP.
Au jour 28, recherchez des cellules rondes appelées PMP dans le surnageant. Ensuite, collectez le milieu contenant les PMP à l’aide d’une pipette de 10 millilitres et d’un pipetter automatique sans déranger les EB. Transférer les PMP dans le milieu dans un tube conique de 15 millilitres.
Centrifuger les PMP collectés à 200 fois g pendant quatre minutes et aspirer le surnageant avant de les remettre en suspension dans un à deux millilitres de cellules de type microglie, ou milieu basal IMG. Ensuite, comptez les cellules sur l’hémocytomètre comme décrit précédemment. Centrifuger le reste des cellules et diluer les PMP à la concentration désirée.
Ensuite, plaquer les cellules à une densité de 10 à la cinquième cellule par centimètre carré sur des plaques traitées par culture cellulaire en utilisant un milieu complet IMG fraîchement préparé. Pour le dosage de la phagocytose sur cellules vivantes, plaquer 20 à 30 fois 10 au quatrième PMP dans une plaque de 96 puits et 100 microlitres de milieu complet IMG et suivre le processus de différenciation pendant 10 jours. Le jour de l’essai, retirez 40 microlitres de milieu par puits et ajoutez 10 microlitres de solution de coloration nucléaire.
Incuber l’assiette pendant deux heures. Décongeler les synaptosomes marqués sur de la glace et sonicer doucement à l’aide d’un sonicateur d’eau pendant une minute. Encore une fois, placez immédiatement les synaptosomes sur la glace.
Diluer les synaptosomes marqués dans un milieu complet IMG à un microlitre de synaptosomes par 50 microlitres de milieu. Pour le contrôle négatif, préparer 60 micromolaires de cytochalasine D dans un milieu complet IMG pour inhiber la polymérisation de l’actine, et donc la phagocytose. Ajoutez ensuite 10 microlitres de cette solution à chaque puits pour une concentration finale de 10 micromolaires, et incuber pendant 30 minutes.
Retirez la plaque de l’incubateur et incuber à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenez la plaque sur de la glace et ajoutez 50 microlitres de milieu contenant des synaptosomes. Centrifuger la plaque à 270 fois g pendant trois minutes à 10 degrés Celsius et maintenir la plaque sur la glace jusqu’à l’acquisition de l’imagerie.
Insérez la plaque dans un lecteur d’imagerie de cellules vivantes et sélectionnez les puits à analyser. Sélectionnez ensuite un objectif 20X. Ensuite, réglez la mise au point, la diode électroluminescente ou LED, l’intensité, le temps d’intégration et le gain des canaux de champ clair et bleu.
La fluorescence des synaptosomes devrait être négligeable au point temporel initial. Sélectionnez le nombre de tuiles individuelles à acquérir dans un montage par puits. Acquérir 16 tuiles au centre du puits, en imageant environ 5% de la surface totale du puits.
Réglez la température à 37 degrés Celsius et l’intervalle de temps souhaité pour l’imagerie. Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse. Ouvrez ensuite l’expérience qui contient les images et cliquez sur l’icône Réduction des données.
Dans le menu, choisissez Assemblage d’images sous Traitement de l’imagerie pour créer une image complète à partir des tuiles individuelles quatre par quatre du montage avec les paramètres décrits dans le manuscrit texte. Définissez un seuil d’intensité à l’aide des canaux DAPI et RFP pour ces images. Ouvrez une image et cliquez sur Analyser.
Sous Analyse, sélectionnez Analyse cellulaire, puis sous Canal de détection, choisissez une image assemblée dans le DAPI ou dans les canaux RFP. Ensuite, accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque principal et nombre) et établissez une valeur de seuil et des valeurs de taille d’objet qui sélectionnent correctement les noyaux de cellule dans le canal DAPI ou le signal synaptosome dans le canal RFP. Pour compter le nombre de noyaux, accédez au menu Réduction des données et, sous Analyse d’image, sélectionnez Analyse cellulaire.
Encore une fois, accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque principal et nombre de personnes) et, sous Channel (Canal), sélectionnez les images cousues DAPI et utilisez les paramètres décrits dans le manuscrit texte. Ensuite, accédez à l’onglet Métriques calculées et sélectionnez Nombre de cellules. Ensuite, pour obtenir la zone du signal synaptomique, allez dans le menu Réduction des données, et sous Analyse, sélectionnez Analyse cellulaire.
Encore une fois, accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque principal et comptage) et, sous Channel (Canal), sélectionnez RFP stowed images et utilisez les paramètres détaillés dans le manuscrit texte. Ensuite, accédez à l’onglet Mesures calculées et sélectionnez Zone de somme d’objets. Dans l’onglet Réduction des données, cliquez sur OK pour permettre au logiciel d’analyser toutes les images acquises.
Une fois les images analysées, exportez les valeurs Zone de somme d’objets et Nombre de cellules pour chaque point temporel. Divisez ensuite la zone de somme d’objets par le nombre de cellules pour calculer la zone normalisée par point temporel. Si vous comparez plusieurs traitements ou génotypes, calculez l’indice de phagocytose à l’aide de l’équation donnée.
Les CSPi indifférenciées présentent une morphologie de colonie compacte avec des bords bien définis. Les CSPi dissociées ont formé des agrégats sphériques appelés EB et ont grandi en taille jusqu’au quatrième jour de différenciation. Lorsque les EB sont plaqués pour la génération de PMP, ils se fixent aux plaques revêtues de Matrigel, et une couche de cellules se répand et entoure les agrégats sphériques.
Au jour 28, des cellules rondes avec un grand rapport cytoplasme/noyau apparaissent dans la suspension. Il est fortement recommandé de cultiver des CSPi dans des plaques revêtues de Laminin 521 au lieu de Matrigel, en raison du rendement PMP plus élevé dans les plaques revêtues de Laminin 521. Après l’exposition des PMP au milieu IMG, les cellules acquièrent une morphologie de type microglie avec un petit cytoplasme en présence de processus allongés.
De plus, l’identité de la microglie a été vérifiée par coloration immunofluorescente. En règle générale, plus de 95 % des cellules expriment IB1 et environ 90 % des cellules expriment P2RY12 et TMEM119. L’analyse par transfert Western a confirmé que l’iPSC dérivait des motoneurones inférieurs pour les marqueurs synaptiques exprimés par les synaptosomes humains, la synaptophysine et la protéine de densité postsynaptique 95.
En contrôle par rapport au point temporel initial, à 10 heures, le signal fluorescent rouge était robuste, car la plupart des synaptosomes avaient été engloutis et étaient localisés dans des compartiments intracellulaires acides. Dans les DIM traités par cytochalasine D, une forte réduction du signal rouge pendant zéro et 10 heures a indiqué que le signal détecté résulte d’événements phagocytaires. La zone des synaptosomes engloutis a augmenté avec le temps jusqu’à 16 heures.
Cependant, la zone de signal rouge des cellules traitées à la cytochalasine D n’a pas augmenté avec le temps. Les cellules de type microglie dérivées de l’iPS peuvent être utilisées pour diverses applications, y compris la phagocytose et la réponse inflammatoire dans l’étude des maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives.
