L’analyse des cellules secondaires de la population est l’une des méthodes couramment utilisées pour isoler et identifier les cellules souches cancéreuses des tissus tumoraux et des lignées cellulaires tumorales. Ce test est pratique, rapide et rentable. Cette méthode peut contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.
De nombreux facteurs peuvent influencer le pourcentage de cellules SP dans cette analyse, il est donc essentiel d’explorer les conditions appropriées avant l’expérience formelle. Ensemencez des cellules tumorales dans une plaque de six puits et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius alimenté en dioxyde de carbone à 5%. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec trois millilitres de PBS.
Ensuite, ajoutez 500 microlitres de 0,25% trypsine-EDTA à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes. Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules, ajoutez trois millilitres de PBS complétés par 2% fbs à chaque puits, et pipettez les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour disperser les amas cellulaires. Examinez la suspension cellulaire au microscope.
Si des touffes cellulaires sont présentes, passez la suspension à travers une passoire de 70 micromètres. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ressuscitez les cellules dans trois millilitres de PBS complétés par 2% FBS, en canalisant les cellules de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger.
Comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre et diluez-les dans du PBS complété par 2% de FPS jusqu’à une concentration finale d’une fois 10 à six cellules par millilitre. Préparez deux tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire à chaque tube. Étiquetez un tube comme un tube à essai et l’autre comme un tube de commande de bloqueur.
Préparer une solution de bloqueur en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube de commande du bloqueur et mélangez bien, puis incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Agiter le tube toutes les 10 minutes.
Préparer une solution de Hoechst 33342 en la diluant à la concentration appropriée. Ajoutez-le au tube à essai et au tube de commande du bloqueur séparément et mélangez bien, puis incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Agiter les tubes toutes les 10 minutes.
Après l’incubation, centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 200 fois g et quatre degrés Celsius, puis aspirer soigneusement le surnageant. Ressuscitez les cellules dans chaque tube avec un millilitre de PBS glacé complété par 2% FBS, puis pipettez les cellules de haut en bas pour mélanger. Ajouter un microlitre d’iodure de propidium d’un milligramme par millilitre, ou PI, à chaque tube et mélanger.
Cliquez sur l’onglet Paramètres dans le logiciel du cytomètre de flux. Tout d’abord, choisissez les paramètres de FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Ensuite, choisissez l’échelle logarithmique pour le paramètre PI.
Enfin, choisissez des échelles de surface et de largeur pour les paramètres FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red et PI, respectivement. Exécutez d’abord les cellules du tube à essai, puis exécutez les cellules du tube de commande du bloqueur en utilisant les mêmes tensions et portes. Collectez 20 à 100 000 événements de chaque échantillon pour analyser le pourcentage de cellules SP.
Cette méthode a été employée pour détecter la proportion de cellules de SP dans la variété de cellule humaine de cancer du sein MDA-MB-231. Le diagramme à points de FSC-A par rapport à PI-A a montré une population de cellules mortes, de débris cellulaires et la population principale de cellules pi négatives, qui a été soumise à une analyse plus approfondie. Une population unicellulaire fermée à partir du diagramme à points de FSC-A par rapport à FSC-W et le diagramme à points de SSC-A contre SSC-W a été utilisé pour analyser la proportion de cellules SP, qui était d’environ 0,9% dans les cellules non traitées et d’environ 0,09% dans les cellules traitées par réserpine.
Différentes concentrations de souillure de Hoechst 33342 ont été examinées sur les cellules MDA-MB-435, et on l’a déterminé que deux microgrammes par millilitre étaient optimaux pour l’analyse de PS. Les basses concentrations ont rendu difficile de distinguer des cellules de SP d’autres populations, tandis que des concentrations élevées ont fait disparaître des cellules de SP. Le vérapamil et le reserpine ont été examinés pour déterminer le bloqueur approprié pour les cellules MDA-MB-435.
Environ 0,4% de cellules ont expulsé le colorant après traitement de vérapamil, mais le rapport a chuté à environ 0,1% après traitement de reserpine, démontrant que le reserpine est un bloqueur plus approprié pour cette variété de cellule. Ce protocole a également été employé pour déterminer la proportion de cellules de SP dans les cellules humaines d’adénocarcinome de poumon A549 traitées avec la colivelin d’activateur STAT3 et dans les cellules humaines de cancer du sein de T47D traitées avec l’inhibiteur FRA1 SKLB816. Ce test fournit des indices sur l’effet régulateur des voies de signalisation sur les caractéristiques des cellules souches cancéreuses et facilite la découverte de nouveaux mécanismes, qui peuvent finalement guider le traitement ciblé des tumeurs.
