Ce protocole est significatif parce que la présence des cellules souches cancéreuses peut être associée à la rechute ou à un mauvais résultat après radiothérapie. L’étude des cellules souches radiorésistantes peut fournir des indices pour surmonter la radiorésistance. Dans cette technique, les cellules souches cancéreuses sont salées avec des marqueurs putatifs par cytométrie d’écoulement et la capacité d’auto-renouvellement des cellules salées est évaluée par essai de formation de sphère.
L’essai de formation de colonie est exécuté pour évaluer la radiosensibilité des cellules salées. Il détermine combien de cellules ont perdu leur capacité à générer la synthèse qui forment la colonie après une certaine dose de rayonnement. Ce manuscrit fournit les premières étapes de l’étude de radiosensibilité des cellules souches cancéreuses, qui établit la base d’une étude plus complète du mécanisme.
L’étude de mécanisme peut impliquer des protéines liées à la réparation de dommages d’ADN, au dégagement des espèces réactives d’oxygène, à l’arrêt de cycle cellulaire, etc. Il fournira des informations importantes sur la façon dont les cellules souches cancéreuses obtiennent la radiorésistance et comment surmonter la résistance. Chen-Nan Li, technicien en radiothérapie de notre service, démontrera la procédure de radiothérapie.
Pour commencer cette procédure, la culture des cellules A549 dans RPMI-1640 moyen complété avec 10%FBS dans des plats de 10 centimètres à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, retirez le milieu de culture. Lavez brièvement les cellules avec trois millilitres de PBS.
Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine de 0,05% à chaque plat. Retirer la trypsine et laisser la trypsine résiduaire pour digérer les cellules à 37 degrés Celsius pendant une à trois minutes. Vérifiez fréquemment le décollement des cellules pour éviter la surdigestion.
Lorsque les cellules se détachent et commencent à se détacher de la vaisselle, ajouter trois millilitres de RPMI-1640 moyen complété par 10%FBS et transférer la suspension des cellules à un tube de 50 millilitres. Centrifugeuse à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en 10 millilitres de PBS.
Transférer 0,5 millilitres de la suspension cellulaire dans un nouveau tube comme contrôle de l’isotype. Centrifugeuse à la fois le contrôle et les tubes expérimentaux à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jeter les surnatants.
Ensuite, diluer à la fois le contrôle fluorescent de l’isotype diconjugué et l’anticorps dans PBS à la concentration optimale titrée pour préparer la solution de travail. Resuspendez le contrôle et les cellules expérimentales avec chaque solution de travail et mélangez doucement. Incuber les échantillons dans l’obscurité et à température ambiante pendant 30 à 40 minutes.
Lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de PBS, en mélangeant doucement et en centrifugant à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez les supernatants et resuspendez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, placez 40 passoires à cellules micrométriques sur de nouveaux tubes de 50 millilitres, en vous assurant de préparer une configuration distincte du tube et de la passoire pour les cellules de contrôle et expérimentales.
Appliquer chaque suspension cellulaire sur la passoire respective et recueillir le flowthrough. Centrifugeuse le débit à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules avec 0,2 à 1,0 millilitres de PBS et transférez chaque suspension cellulaire dans un tube séparé de cinq millilitres pour la cytométrie d’écoulement.
Dans un cabinet de sécurité biologique, préparer une plaque de six puits pour chaque dose de rayonnement, y compris le groupe zéro gris. Ajouter 1,5 millilitres de 1640 supports complétés à chaque puits. Diluer les cellules récoltées avec 1640 corps complétés à une densité cellulaire de 1000 cellules par millilitre.
Ensuite, ajoutez la suspension cellulaire diluée aux puits et secouez les plaques horizontalement pour répartir uniformément les cellules dans les puits. Enregistrez le volume ajouté dans chaque groupe de dose. Culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Une fois que les cellules se sont fixées au fond des puits, ajouter 1640 supports complétés à chaque puits jusqu’à ce que la hauteur des médias atteigne un centimètre. Lorsque les plaques sont transférées entre la salle de culture cellulaire et la salle de radiothérapie, enveloppez les plaques de papier d’aluminium ou mettez-les dans une boîte propre pour éviter la contamination. Maintenez les plaques à plat pour éviter que le milieu ne se déverse.
Ensuite, fixé à 20 centimètres par champ de rayonnement de 20 centimètres. Placez un bolus équivalent tissulaire de 1,0 centimètre d’épaisseur sur le canapé de traitement et placez la plaque de six puits sur le bolus pour les garder en contact. Assurez-vous que toute la plaque se trouve dans le champ de rayonnement.
Réglez la distance source-peau comme 100 centimètres et ajustez la hauteur du canapé de traitement pour aligner le niveau de surface moyen au niveau laser. Livrer la dose assignée à chaque plaque dans l’ordre. Après cela, prenez les plaques à l’armoire de biosécurité dans la salle de culture cellulaire.
Remplacer le milieu de chaque puits par deux millilitres de 1640 médiums complétés. Culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de changer le milieu tous les trois à cinq jours. Sept à dix jours après le rayonnement, retirez le milieu et lavez brièvement les cellules avec du PBS.
Dans un capot de fumée, ajouter un millilitre de formaldéhyde de 4% à chaque puits pour fixer les cellules pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le formaldéhyde et lavez chaque puits deux fois à l’aide de deux millilitres d’eau distillée pour chaque lavage. Ajouter un millilitre de 1% de solution de tache violette cristalline à chaque puits et tacher pendant 10 minutes.
Après cela, retirez la solution de tache violette cristalline et lavez les cellules trois fois avec de l’eau distillée. Retirer l’eau et laisser sécher l’air des plaques pendant 30 minutes. Comptez le nombre de colonies avec plus de 50 cellules.
Dans cette étude, les deux alpha deux delta un haut et alpha deux delta une faible A549 cellules sont triés. Certains marqueurs peuvent montrer des populations distinctes et sont faciles à barrière. Cependant, certains marqueurs montrent juste des modèles d’expression élevés et faibles, plutôt que des populations positives et négatives distinctives.
Dans cette situation, un contrôle isotype est très important pour le gating. L’expression de l’alpha deux delta un dans les cellules triées est validée par qPCR. L’expression de CACNA2D1, le gène qui code alpha deux delta un, est plus élevée dans l’alpha trié deux delta une cellules élevées par rapport à alpha deux delta une cellules basses.
La morphologie typique des sphères et l’efficacité de la formation de la sphère sont montrées ici. Alpha deux delta une cellule haute montrent une efficacité de formation de sphère plus élevée, suggérant une capacité d’auto-renouvellement plus élevée. Des images typiques des colonies et des courbes de survie sont montrées ici.
Une colonie d’environ 50 cellules peut être examinée au microscope et marquée comme référence. Le nombre de colonies est compté, puis une fraction de survie à chaque dose peut être calculée et une courbe de survie peut être tracée. Alpha deux delta une cellule haute sont relativement résistants au rayonnement par rapport à alpha deux delta une cellule basse.
Toutes les étapes liées à la culture cellulaire doivent être effectuées dans l’armoire de sécurité biologique ou le banc propre laminaire. Pour éviter la contamination, il est recommandé d’ajouter des antibiotiques au milieu de culture après le tri. Quand un marqueur putatif de cellules souches de cancer est préliminairement identifié par l’essai de formation de sphère, davantage de caractérisation par l’essai limitant in vivo de dilution peut être exécutée pour évaluer la capacité tumorigenic.
À partir de l’étude de mécanisme de la radiorésistance, les chercheurs peuvent examiner la protéine liée à la réparation des dommages à l’ADN, le dégagement des espèces réactives d’oxygène, et l’arrêt du cycle cellulaire en réponse aux radiations. Pendant le rayonnement cellulaire, veuillez noter que l’accélérateur linéaire ne peut être actionné que par des techniciens qualifiés. Tenez-vous à l’écart des radiations.
Debout, veuillez noter que le formaldéhyde est volatil et dangereux. Utilisez du formaldéhyde dans le capot de fumée.
