Nous remercions le Dr Roger Erickson pour son soutien et aide à la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute à la National Institutes of Health (Grant Nombre RO1CA177984; RO1CA138642), le projet de programme de VA sur cancer de la prostate (BX001604).

Échantillons frais cancer de la prostate congelés fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) ou ont été obtenues à partir de la SFVAMC. Les échantillons provenaient de patients atteints de cancer de la prostate qui ont subi une prostatectomie radicale SFVAMC. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et l&#39;étude a été approuvée par le Comité sur la recherche humaine UCSF. Alternativement, les tissus de cancer de la prostate puces ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés pour miARN analyses par ISH. Informations clinico-pathologique et le suivi des patients atteints de cancer de la prostate analysées ont été recueillies. 1. Les échantillons de tissus <ol><li> Couper des échantillons de tissu de cancer de la prostate dans 10 um sections à l&#39;aide d&#39;un microtome et coloration à l&#39;H &amp; E en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Revoir lames colorées pour l&#39;identification de la prostate foyers de cancer ainsi que épithélium glandulaire normal adjacent. Remarque: Un conseil certifié pathologiste doit examiner les diapositives H &amp; E colorées et mark de zones normales et tumorales. Utilisez les diapositives marqués comme guides dans les sections suivantes pour miARN analyses de la tumeur vs zones normales. </li></ol> 2. miRNA expression analyses par PCR quantitative en temps réel Remarque: Ce flux de travail comprend les étapes suivantes: microdissection laser, l&#39;isolement de l&#39;ARN total (y compris les miARN et ARNm), le dosage des miARN matures en utilisant les tests d&#39;expression TaqMan microARN comme détaillé dans les sections suivantes. <ol><li> Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus FFPE <ol><li> Microdissection laser (LCM) Remarque: Effectuer les étapes 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 dans une hotte chimique. <ol><li> Préparer des lames de tissus (10 um sections) pour LCM. Sections Deparrafinize de tissu par trempage dans du xylene (2 x), pendant 10 minutes chacun, puis réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min chacun dans de l&#39;éthanol à gradient (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), suivie de distillation eau(5 min). </li><li> Après réhydratation, les sections de tache avec de l&#39;hématoxyline pendant 30 secondes puis de l&#39;eau. </li><li> La place les tissus dans de l&#39;éthanol gradué (70%, 95% à 90%, 80%, 70%) (5 min chacun) et du xylene (5 min). </li><li> Diapositives sec dans une hotte et les placer dans l&#39;instrument de LCM pour microdissection. </li><li> Effectuer microdissections avec le système LCM en conformité avec les instructions du fabricant 24. Utiliser pathologiste balisé diapositives comme guides pour l&#39;identification de la prostate foyers de cancer ainsi que le tissu normal adjacent. Utiliser le faisceau laser à impulsions d&#39;un diamètre de 10-20 pm avec une puissance de 70 à 90 mW. </li><li> Les zones de capture d&#39;intérêt avec des impulsions laser infrarouges sur un bouchon d&#39;LCM. Combiner les cellules de 2-5 bouchons pour l&#39;extraction miARN par échantillon. Pour garantir l&#39;intégrité de l&#39;ARN extrait, traiter immédiatement cellules capturées pour l&#39;extraction miARN. </li><li> En variante, des cellules de lyse dans le tampon d&#39;extraction miRNA (selon le protocole du fabricant) et store lysats à -80 ° C. </li></ol></li><li> Extraction miARN et Analyses de LCM microdisséquées tissus <ol><li> Extraire l&#39;ARN total à partir de tissus FFPE microdisséquées utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Le rendement de l&#39;ARN à partir de capture laser miscrodissection est généralement faible. Par conséquent, l&#39;ARN est élue dans de faibles volumes (20-30 pi) et utilisé pour le profilage d&#39;expression en utilisant Taqman microARN essais d&#39;expression suivant les instructions du fabricant (également décrits dans la section 2.2). Optimisation de l&#39;ARN d&#39;entrée pour la détection de PCR en temps réel de miARN matures suggère que 5 ul de l&#39;ARN élue est optimale pour chaque réaction de transcription inverse spécifiques à des miARN. Comme un contrôle endogène, RNU48 / RNU24 est utilisé. Pour les réactions témoins, 2 ul de l&#39;ARN élue est utilisé pour la réaction de transcription inverse. </li></ol></li></ol></li><li> Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus congelés <ol><li> Homonize tissus prostatiques réséquées congelés par broyage des tissus dans de l&#39;azote liquide en utilisant un mortier et un pilon. Transfert homogénéisés de tissu un tube de microcentrifugation en utilisant une spatule refroidi. Maintenir le mortier / pilon et spatule à la même température en plongeant dans l&#39;azote liquide afin tissu homogénéisé peut être facilement transféré. </li><li> Ajouter commercial isothiocyanate de guanidine-phénol réactif (1 ml / 0,1 g de tissu) dans le tissu homogénéisé et incuber à température ambiante pendant 5 min. Remarque: les tissus homogénéisés dans la guanidine réactif isothiocyanate-phénol commerciale peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Ajouter le chloroforme à l&#39;homogénat (0,2 ml de chloroforme / ml) et agiter vigoureusement pendant 30 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 3-5 min, suivie d&#39;une centrifugation à 10 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube stérile frais 1,5 ml sans RNase. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;alcool isopropylique. Mélanger et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante suivie par centrifugation à 12.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter l&#39;ARN. </li><li> Aspirer le surnageant et laver le culot d&#39;ARN avec 1 ml d&#39;éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12.000 g pendant 10 min à 4 ºC. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant. Culots d&#39;ARN à sec à température ambiante pendant 5-10 min. Dissoudre ARN dans 50-100 eau sans nucléase ul. </li><li> Effectuer la quantification de l&#39;ARN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop et de déterminer l&#39;intégrité de l&#39;ARN avec un bioanalyseur. Ajuster la concentration d&#39;ARN de 10 ng / ul. Utilisez 10-50 ARN ng pour miRNA- réaction d&#39;ADNc spécifique suivie en temps réel par les analyses PCR (section 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitative en temps réel pour miRNA expression Analyses Remarque: miARN matures dosage en utilisant un protocole de RT-PCR en deux étapes comme décrit ci-dessous. <ol><li> Transcription inverse (RT) <ol><li> Transcription inverse de l&#39;ARN à partir de l&#39;ADNc en utilisant un kit de transcription inverse miRNA conformément aux instructions du fabricant.Utilisez 10-50 ng d&#39;ARN total avec miARN amorce spécifique du kit microARN dosages et RT. Utilisez RNU48 / RNU24 / RNU6B comme témoins. Diluer ADNc 1: 5 à 1:10 (en fonction de l&#39;abondance du miRNA analysé) et utiliser dans la détection en temps réel PCR comme décrit dans l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> PCR en temps réel pour la détection de miARN mûr <ol><li> Amplifier les produits de PCR à partir d&#39;échantillons d&#39;ADNc en utilisant les tests de microARN avec un mélange maître universel rapide en conformité avec les instructions du fabricant. Normaliser échantillons à RNU48 / RNU24 / contrôle de RNU6B. Utilisez la méthode comparative Ct (cycle seuil) pour calculer les changements relatifs dans l&#39;expression des gènes sur le système de PCR en temps réel rapide. Analyser chaque échantillon en triple exemplaire. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA expression analyses par hybridation in situ (ISH) <ol><li> Pré-traitement des tissus <ol><li> Couper coupes de 5 um à partir de blocs de tissus cancéreux de la prostate FFPE utilisant un microtome. </li><li&gt; fix coupes de tissu par incubation des lames à 56 ° C pendant 1 heure. Remarque: Les diapositives peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs semaines pour les analyses de miARN. </li><li> Deparrafinize les tissus en trempant les lames avec du xylene (2 x), pendant 15 minutes chaque. </li><li> Réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min dans de l&#39;éthanol gradué chaque (de 100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) puis de l&#39;eau distillée (5 min). </li><li> Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS à la température ambiante pendant 20 min. </li><li> Laver les lames avec du PBS (2x) à la température ambiante pendant 5 minutes chacun. </li><li> Traiter les lames avec 10 ug / ml de proteinase K à 37 ° C pendant 10 min dans du tampon K proteinase préchauffé (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 1 mM de NaCl). </li><li> Après le traitement à la protéinase-K, rincer les lames avec 0,2% de glycine dans du PBS pendant 30 sec. </li><li> Laver les lames dans du PBS (1x) à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avecPBS pendant 5 min. </li></ol></li><li> Hybridation <ol><li> Pré-hybrider les diapositives avec solution de pré-hybridation pendant 3-4 heures à 55 ° C dans une chambre humidifiée. Utiliser des lingettes de laboratoire de tissus imbibés de formamide à 50% / 50% 5x SSC de garder la chambre humidifié. </li><li> Utilisez 5 &#39;des sondes marquées à la digoxigénine à une concentration de 20 à 50 nM dans du tampon d&#39;hybridation. Diluer sonde spécifique miARN (20-50 nM) et une petite sonde de contrôle de U6 ARN nucléaire (20 nM), la chaleur à 90 ° C pendant 4 min, placez-le sur la glace, et d&#39;ajouter de la glace tampon d&#39;hybridation à froid (2-4 ng / pl ). </li><li> Retirer solution de pré-hybridation, ajouter la solution d&#39;hybridation (sonde + tampon d&#39;hybridation, 100 pi par diapositive), incuber pendant 12-16 h à la température d&#39;hybridation spécifique sonde (température = hybridation sonde-Tm 21 ºC). Effectuer des hybridations dans une chambre humidifiée (50% de formamide / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Les étapes de lavage <ol><li> Laver les lames avec 2x SSC pendant 10 min à 45 ° C. </li><li> Laver til glisse avec 1,5x SSC pendant 10 min à 45 ° C. </li><li> Laver les lames avec 0,2x SSC (2x) à 37 ºC pendant 20 minutes chacun. </li><li> Incuber les lames avec une solution de blocage de 1x pendant 1-2 heures à la température ambiante </li></ol></li><li> Détection <ol><li> Incuber les lames avec 1: 100 PBS dilué anticorps anti-digoxigénine conjugué AP-pour 1-4 heures ou une nuit à 4 ºC. </li><li> Laver les lames avec du PBS (3x) à température ambiante pendant 10 minutes chacun. </li><li> Laver les lames (2x) avec de la phosphatase alcaline tampon (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à température ambiante pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber les lames dans le substrat BM Violet AP dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 1-20 h. </li><li> Rincer les lames avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20 et lavage (2x) dans l&#39;eau. </li><li> Monter les lames en utilisant un milieu de montage aqueux et d&#39;examiner sous un microscope. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

Dans cet article, nous décrivons un flux de travail simplifié pour l&#39;expression du miARN profilage dans FFPE archivé ou tissus cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé. Dans le cancer de la prostate, plusieurs études suggèrent un rôle important des microARN dans cancer de la prostate initiation, la progression et les métastases. Cependant, des résultats contradictoires sont souvent obtenus sur un miRNA spécifique 22 depuis l&#39;extraction des miARN et analyses méthodes diffèrent l...

Cancer de la glande de la prostate est une tumeur maligne mâle fréquemment diagnostiqué qui est l&#39;une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes. Aux États-Unis, on estime que 220,800 nouveaux cas et 27,540 décès seront rapportés en 2015 1. Cancer de la prostate est une maladie hétérogène avec une maladie très variable Cours-tumeurs peuvent être indolent ou très agressif. Un défi majeur dans le cancer de prostate gestion clinique est posé par l&#39;insuffisance des méthodes actuellement utilisées / biomarqueurs pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement 2. Méthodes de dépistage actuelles comprennent l&#39;antigène (PSA) des tests spécifiques de la prostate et un toucher rectal (DRE), suivi par biopsies de la prostate 3. Antigène spécifique de la prostate (PSA) est le biomarqueur du cancer de la prostate le plus largement utilisé qui a considérablement révolutionné la gestion clinique et l&#39;amélioration des taux de survie 4. Toutefois, en raison des limites inhérentes de PSA incluant le lack de spécificité, le dépistage à base de PSA-dessus a conduit à un diagnostic et un traitement sur de la maladie. Dans cette perspective, des efforts intensifs sont dirigés vers la recherche de biomarqueurs du cancer de la prostate de rechange, en particulier ceux qui peuvent prédire l&#39;agressivité de la maladie et de conduire de meilleures décisions de traitement 4,5. Au cours des quelques dernières années, les microARN (miARN) sont apparus comme des biomarqueurs du cancer de la prostate alternatives prometteuses. Les microARN (miARN) constituent une classe évolutif conservé de petits ARN non-codants qui suppriment l&#39;expression génique post-transcriptionnelle par des interactions spécifiques de séquence avec les régions non traduites 3 &#39;UTR () de cibles d&#39;ARNm apparentés. On estime que&gt; 60% des ARNm cibles sont conservées de miARN 6. miRNA gènes sont situés dans les régions intergéniques ou dans des introns ou exons de protéines / non-protéique gènes codant 7. Ces gènes sont préférentiellement transcrites par l&#39;ARN polymérase II dans primamiARN ry (pri-miARN, plusieurs kilobases de long) qui forment en épingle à cheveux en forme de tige-boucle structures secondaires. Ces pri-miARN sont transformées en précurseurs miARN (pré-miARN, 60-75 nucléotides de long) qui sont exportés vers le cytoplasme et traitées ultérieurement dans miARN matures (18-25 nucléotides de long) 8-10. miARN régulent les processus cellulaires clés, y compris la prolifération, le développement, la différenciation et l&#39;apoptose 11. Des études suggèrent une dérégulation généralisée des profils d&#39;expression de miARN dans diverses affections malignes humaines, notamment le cancer de la prostate de 12 à 15. les profils d&#39;expression de miARN ont été rapportés pour être largement dérégulée dans le cancer de la prostate primaire et métastatique. L&#39;expression du miARN modifié ont été liés à la progression du cancer de la prostate, de l&#39;agressivité et de la récurrence soulignant le potentiel pronostique des miARN 12,14,16-19. Un nombre croissant de preuves indique que miARN jouent des rôles importants dans l&#39;initiation mécanistes de cancer de la prostate, le développement, le progrèsion et les métastases. Globalement, miARN sont en train de biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic qui peuvent distinguer entre les tissus normaux et cancéreux et de l&#39;aide dans la stratification des tumeurs de la prostate 12. Aussi, miARN sont des cibles importantes pour le développement de traitements efficaces contre le cancer de la prostate 20. En raison de leur petite taille et de résistance à l&#39;activité de RNase endogène, miARN sont biomarqueurs stables qui peuvent être facilement détectés dans les tissus fixés au formol et 21 biopsies de la prostate 22. En outre, les profils d&#39;expression des miARN ont été comparés dans les tissus fixés au formol et congelés et ont été trouvés à être fortement corrélé 21. Toutefois, l&#39;expression des miARN profilage dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l&#39;hétérogénéité tumorale, les erreurs d&#39;échantillonnage, la contamination du stroma etc. Le développement des miARN comme biomarqueurs efficaces pour cancer de la prostate fortement relies sur leur détection précise dans les tissus cliniques. Nous décrivons ici un workflow simplifié utilisé dans notre laboratoire pour l&#39;expression des miARN profilage dans FFPE archivé ou échantillons cliniques de cancer de la prostate frais congelé. Nous employons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l&#39;hybridation in situ pour les miARN dans les analyses d&#39;échantillons cliniques, avec l&#39;ancien donnant davantage d&#39;informations quantitatives et celui-ci pour visualiser l&#39;expression différentielle des biomarqueurs miARN potentiels dans un éventail de tissus. Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l&#39;extraction miARN de FFPE et les tissus de la prostate congelés, les analyses d&#39;expression par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR et miARN technique d&#39;hybridation in situ en utilisant l&#39;acide nucléique verrouillé (LNA) à base de sondes 23. Sondes à base de LNA offrent une sensibilité et une spécificité accrue par rapport à l&#39;ADN ou de l&#39;ARN sondes basées et permet une détection robuste de toutes les séquences de miARN, quelle que soit leur teneur en GC et permettent également discrimination des familles de miARN. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offrant la possibilité d&#39;accélérer la découverte de biomarqueurs miARN.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus Autopix for LCM</td>
			<td>Arcturus/ Life Technologies</td>
			<td>LCM1621/LCM1110</td>
			<td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real Time PCR System&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Universal PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG labeled LNA probe for U6</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>99002-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple AP substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-5501&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL201&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

Un défi essentiel à cancer de la prostate (CaP) prise en charge clinique est posé par l&#39;insuffisance des biomarqueurs actuellement utilisés pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement. Au cours des dernières années, les microARN (miARN) ont émergé biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic. Cependant, le développement de biomarqueurs miARN comme efficaces pour cancer de la prostate repose en grande partie sur leur détection précise dans les tissus cliniques. miARN analyse des spécimens cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l&#39;hétérogénéité tumorale, les erreurs d&#39;échantillonnage, la contamination du stroma, etc. Le but de cet article est de décrire un flux de travail simplifié pour miARN analyse en FFPE archivé ou spécimens cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé en utilisant une combinaison de quantitative PCR en temps réel (RT-PCR) et l&#39;hybridation in situ (ISH). Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l&#39;extraction de miARN FFPE et tissu de la prostate gelées et l&#39;expression analyses par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR. En outre, nous décrivons une méthode optimisée pour ISH analyse de la détection formiRNA dans les tissus de la prostate à l&#39;aide de l&#39;acide nucléique verrouillé (LNA) - sondes basées. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA).

Expression profiling de miR-203 dans des échantillons cliniques LCM prostate primaire de cancer par analyse RT-PCR (Figure 1) Les analyses par RT-PCR de l&#39;expression par rapport miR-203 dans des tissus de cancer de la prostate primaire LCM et les régions adjacentes appariées normales a été réalisée comme décrit dans l&#39;Saini et al. RNU48 15 a été utilisé comme témoin. Le tableau suivant résume l&#39;expression relative miR-203 dans des...

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K vues.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Recherche

Médecine

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

Analyses de la population de cellules pendant la carcinogenèse cutanée

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

M. imagerie moléculaire du cancer de la prostate avec un agent de contraste ciblé Petit moléculaire CLT1 Peptide

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Travailler avec les tissus humains pour la recherche translationnelle sur le cancer

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients&#039; Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

Exosomal miRNA Analyse en non-small cell lung cancer (NSCLC) Plasma de patients Par qPCR: A Faisable Liquid Biopsie outil

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...