L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule et induite par les protéines peut compléter les mesures FRET à molécule unique lors de l’étude des sous-populations structurelles et des conformations des protéines, en particulier dans les cas où des sous-populations structurelles distinctes rendent compte de structures locales stables. Le principal avantage de cette technique est qu’elle capture des sous-populations structurelles distinctes spécifiques au site en fonction de la proximité du site de étiquetage du colorant aux surfaces protéiques. L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule et induite par les protéines peut être appliquée à n’importe quel système biomoléculaire d’intérêt pour sonder des sous-populations distinctes, locales et structurelles.
Commencez par préparer 25 alpha-synucléine picomolaires marqués Sulfo-Cy3 dans un tampon de mesure dans un tube de liaison à faible teneur en protéines. Ajouter 100 microlitres d’un milligramme par millilitre de BSA à la lame de couverture de microscopie à 18 chambres et incuber pendant une minute, puis jeter le BSA. Ajouter 100 microlitres de 25 échantillons picomolars d’alpha-synucléine marqués Sulfo-Cy3 dans la chambre de la lame de couvercle.
Ensuite, pour l’acquisition de données, ajoutez une goutte d’eau ultrapure sur le dessus de la lentille de l’objectif à immersion dans l’eau à haute ouverture numérique, fixez la glissière de glissement du couvercle dans la chambre de scène, puis installez l’ensemble sur le dessus de l’étage du microscope. Amenez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que la gouttelette d’eau sur le dessus de l’objectif s’étale au bas de la glissière de couverture et ouvrez l’obturateur laser. Lorsque l’objectif se déplace vers le haut, inspectez le motif des anneaux aérés sur une caméra CCD.
La première bague représente la mise au point à l’interface eau/verre, et la seconde bague représente la mise au point à l’interface entre le verre et la solution échantillon. Augmentez la hauteur de la lentille de l’objectif de 75 micromètres pour amener la mise au point laser profondément dans la solution afin de minimiser l’autofluorescence de la surface en verre du couvercle. Réglez la puissance laser à la lentille de l’objectif d’environ 100 microwatts.
Démarrez l’acquisition des photons détectés pendant un temps prédéfini. Ouvrez les blocs-notes Jupyter, puis ouvrez l’exemple de bloc-notes. Chargez le fichier de données FRETBursts et Photon-HDF5.
Utilisez l’histogramme des temps interphotoniques pour calculer les taux d’arrière-plan pour chaque 30 secondes d’acquisition de données. Déplacez une fenêtre temporelle d’un photon à la fois pour 20 photons consécutifs et collectez les données sur les photons si le taux de photons instantané f est au moins 11 fois supérieur au taux de fond pour cette période d’acquisition de données. Calculez la taille et la quantité de photons dans un sursaut, la durée du sursaut, la différence de temps entre le dernier et le premier temps de détection de photons dans un sursaut, la luminosité du sursaut, la plus grande valeur du taux de photons instantanés dans un sursaut, et la séparation du sursaut, l’intervalle de temps entre les sursauts consécutifs.
Tracez l’histogramme des valeurs de luminosité de rafale avec l’axe des événements dans une échelle logarithmique. Définissez le seuil de luminosité de rafale comme la valeur de luminosité de rafale minimale à partir de laquelle l’histogramme présente un motif de désintégration, puis sélectionnez les rafales avec des valeurs de luminosité supérieures au seuil de luminosité de rafale. Pour la mesure de la durée de vie moyenne de la fluorescence, tracez l’histogramme du nanotemps des photons pour tous les photons dans les sursauts sélectionnés avec l’axe du nombre de photons à l’échelle logarithmique.
Définissez le seuil de nanotemps comme la valeur minimale de nanotemps à partir de laquelle l’histogramme des nanotemps de photons présente un motif de désintégration. Sélectionnez uniquement les photons dont les nanotemps sont supérieurs au seuil de nanotemps. Calculer la moyenne algébrique de tous les nanotemps photoniques sélectionnés.
Soustrayez le seuil de nanotemps de la moyenne algébrique du nanotemps des photons. La valeur obtenue est le nanotemps moyen des photons du sursaut, directement proportionnel à la durée de vie moyenne de la fluorescence. Tracez l’histogramme de toutes les durées de vie moyennes de fluorescence de l’éclatement.
Les sous-populations de fluorescence distribuées centralement peuvent apparaître. Les sous-populations avec des moyennes de valeur plus faible représentent les espèces moléculaires avec Sulfo-Cy3 qui n’ont pas été obstruées stériquement, tandis que les sous-populations avec des moyennes de valeur plus élevée représentent les espèces moléculaires avec S-Cy3 qui étaient plus stériquement obstruées. Pour l’évaluation de la dynamique lente entre les rafales, tracez l’histogramme des temps de séparation des rafales avec un axe de temps de séparation dans une échelle logarithmique.
Sélectionnez cette option pour enregistrer toutes les paires de sursauts consécutifs qui sont séparés par un temps de séparation inférieur à un temps de séparation maximal qui définit la sous-population de même molécule. Tracez un histogramme ou un nuage de points des durées de vie moyennes de fluorescence des premier et deuxième sursauts pour toutes les paires de sursauts qui se sont reproduits en dessous d’un certain seuil de temps de séparation. Les histogrammes des durées de vie moyennes de fluorescence d’une seule molécule alpha-synucléine-56 marquée S-Cy3 ont montré que la première sous-population avait une durée de vie de fluorescence caractéristique de 1,6 nanoseconde et représentait des états conformationnels d’alpha-synucléine avec peu de surfaces protéiques au voisinage du résidu 56.
La deuxième sous-population avait une durée de vie de fluorescence caractéristique de 3,5 nanosecondes et représentait des états conformationnels d’alpha-synucléine avec plus de surfaces protéiques à proximité du résidu 56. Les segments des composants bêta non amyloïdes des molécules d’alpha-synucléine sont connus pour adopter une structure hélicoïdale en épingle à cheveux lors de la liaison aux vésicules SDS, ce qui a été confirmé comme une population à vie de florescence unique avec une durée de vie caractéristique d’environ trois nanosecondes, et l’absence de la sous-population avec une durée de vie caractéristique de 1,6 nanoseconde. L’histogramme des temps de séparation entre les sursauts consécutifs d’une seule molécule rapporte des molécules récurrentes pour les temps de séparation plus rapides que 100 millisecondes, où les premier et deuxième sursauts proviennent de la même molécule.
L’histogramme moyen de la durée de vie de fluorescence de tous les sursauts de molécules uniques a montré des sous-populations avec une courte durée de vie caractéristique, ainsi qu’avec une longue durée de vie caractéristique, ce qui indique que les molécules individuelles pourraient subir des transitions entre différentes valeurs de durée de vie moyenne plus lentes que les durées de rafale. Dans des temps de séparation de rafale de 100 millisecondes au maximum, il y avait une fraction de molécules qui ont commencé comme un premier sursaut dans la sous-population à courte durée de vie, et qui se sont reproduites comme un deuxième sursaut dans la sous-population à longue durée de vie. Alors que la fraction de molécules qui a commencé comme un premier sursaut dans la sous-population à longue durée de vie, et qui est réapparaie comme un deuxième sursaut dans la population à courte durée de vie, indique les transitions entre les deux sous-populations dans les 10 à 100 millisecondes.
La chose la plus importante à retenir lors de l’analyse des résultats expérimentaux est de séparer correctement les signaux de fluorescence d’une seule molécule de l’arrière-plan et d’analyser les sursauts avec suffisamment de nanotemps de photons. Le développement de smPIFE a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les interactions des protéines d’acide nucléique au niveau de la molécule unique. Cette avancée jette les bases de l’étude de la dynamique structurelle locale au sein des protéines.
