Ce protocole est important car il fournit la procédure complète pour créer des gouttelettes du film lipidique à la solution lipidique aux microbulles puis aux gouttelettes. Le principal avantage de cette technique est la simplicité de condensation des microbulles en gouttelettes. Juste en refroidissant et en tourbillonnant, les gouttelettes peuvent être faites sans avoir besoin de pressurisation.
Une démonstration visuelle est essentielle car un test simple pour voir si les microbulles ont été condensées avec succès consiste à vérifier visuellement le changement de translucidité. Kimoon Yoo, étudiant à la maîtrise dans le laboratoire Gang Zheng, fera la démonstration de la procédure. À l’aide d’un décapant, retirez le joint en aluminium sur le flacon de sérum et transférez un millilitre de la solution lipidique dans un flacon d’échantillon de verre borosilicate de 1,85 millilitre avec un bouchon à vis phénolique en laissant la solution lipidique s’écouler le long de la paroi intérieure sans créer de bulles.
Avec le flacon d’échantillon de 1,85 millilitre, préparez-vous à faire circuler du décafluorobutane dans l’espace de tête du flacon d’échantillon à l’aide de l’échangeur de gaz. Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont correctement fermées et que la pompe est éteinte. Ouvrez la vanne du collecteur et détez soigneusement l’aiguille correspondante du collecteur.
Ouvrez la soupape de pression A et la soupape de pression B et tournez la vanne de la bouteille de gaz environ 1/16 à 1/8 dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour l’ouvrir partiellement. Ouvrez la valve de poignée en T et dévissez le flacon d’échantillon avec la solution lipidique. Placez l’aiguille du collecteur au-dessus de l’interface d’air liquide du flacon, tournez lentement la vanne du régulateur d’air dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’aiguille de la jauge du régulateur d’air se déplace légèrement de sa position de repos et laissez le gaz perfluorocarboné s’écouler doucement dans l’espace de tête du flacon pendant 30 secondes, en prenant soin de ne pas créer de bulles.
Réglez la vanne du régulateur d’air si nécessaire. Après 30 secondes, conserver soigneusement et rapidement le flacon d’échantillon sans trop déplacer le flacon. La vanne de bouteille de gaz, la vanne de poignée en T, la vanne de régulation d’air, la soupape de pression A, la soupape de pression B et la vanne de collecteur.
Gainez soigneusement l’aiguille, puis étiquetez le flacon d’échantillon et scellez le cou avec un film de cire dans le sens des aiguilles d’une montre. Conservez le flacon d’échantillon dans l’obscurité et à quatre degrés Celsius pendant au moins 10 minutes ou jusqu’à 24 heures. Placez environ 100 grammes de glace carbonique dans un récipient isotherme en place de la glace ordinaire dans un autre récipient isotherme.
Récupérez un flacon de sérum de décafluorobutane préalablement préparé dans des aiguilles de calibre 20 de 1,5 pouce, une seringue en plastique d’un millilitre, un récipient de 200 millilitres, des pinces en métal et un thermomètre. Placer le flacon d’échantillon avec la solution lipidique dans l’agitateur mécanique et agiter pendant 45 secondes. Il devrait y avoir un changement de couleur et de translucidité.
Après l’agitation mécanique, placez le flacon d’échantillon du côté droit à l’abri de la lumière et commencez un compte à rebours de 15 minutes pour refroidir le flacon et sélectionnez la taille des microbulles. Lorsque le compte à rebours a atteint 10 minutes, remplissez un récipient avec environ 200 millilitres d’isopropanol et refroidissez-le à moins 20 degrés Celsius avec de la glace carbonique à l’aide de pinces métalliques. Une fois que les microbulles ont été sélectionnées pendant 15 minutes, recherchez la partition de taille sélectionnée à l’intérieur du flacon d’échantillon.
En gardant le flacon d’échantillon côté droit vers le haut, en déplafonner soigneusement le flacon d’échantillon et en prélever environ 0,7 millilitre de la cloison inférieure avec une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce attachée à une seringue en plastique d’un millilitre. Assurez-vous qu’aucune des cloisons supérieures n’est retirée et ne faites pas glisser la seringue pour retirer les poches d’air. En visant le cercle central sur le bouchon en caoutchouc, insérez une aiguille de calibre 20 différente dans un flacon de sérum décafluorobutane tout en gardant l’aiguille près du haut du flacon de sérum pour éventiler, puis insérez l’aiguille avec les microbulles de taille sélectionnée.
Transférez lentement la taille des microbulles sélectionnées. Laissez le liquide glisser doucement le long de la paroi intérieure du flacon de sérum de décafluorobutane. Une fois que toute la solution de microbulles sélectionnée a été transférée, retirez l’aiguille avec la seringue, mais gardez l’aiguille de ventilation à l’intérieur pour soulager la pression négative.
Ajoutez de petites quantités de glace carbonique ou d’isopropanol à température ambiante au bain d’isopropanol pour vous assurer que la température du bain se situe entre moins 15 et moins 17 degrés Celsius. Avec l’aiguille de ventilation de calibre 20 insérée près du haut du flacon de sérum, placez le flacon de sérum et le bain d’isopropanol, en maintenant le niveau de microbulles en dessous du niveau de l’isopropanol, mais le col du flacon au-dessus et faites tourbillonner par intermittence le flacon de sérum pendant deux minutes pour condenser les microbulles. Ne pas faire tourbillonner le flacon de sérum en continu dans l’isopropanol et ne pas laisser la solution geler.
Tourbillonner pendant environ cinq secondes et soulever le flacon de sérum de l’isopropanol. Vérifiez s’il n’y a pas de nucléation de glace, puis recommencez à tourbillonner dans l’isopropanol. S’il y a formation de glace, faites tourbillonner le flacon de sérum dans l’air jusqu’à ce qu’il se dissipe.
Après les deux minutes de condensation, retirez le flacon de sérum du bain d’isopropanol et retirez l’aiguille de ventilation. Les microbulles doivent s’être condensées en gouttelettes comme l’indique le changement de translucidité. Essuyez le flacon de sérum, étiquetez-le et placez-le sur de la glace ordinaire dans un récipient isotherme sombre jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Les gouttelettes non ouvertes avec un joint en aluminium intact doivent être stables jusqu’à six heures tant que la glace fondue est remplacée au besoin. Lorsqu’il est prêt à l’emploi, retirez le joint en aluminium avec le décapant. Après avoir utilisé ce protocole, des microbulles pré-condensées de taille sélectionnée et des gouttelettes post-condensées ont été dimensionnées sur un compteur Coulter avec une ouverture de 10 microns.
Les données de dimensionnement pour la formulation pyro-lipidique à 30% sont indiquées. Les statistiques basées sur les données de dimensionnement sont présentées ici. En utilisant un rapport entre les diamètres moyens pré-condensés et post-condensés, les résultats ont montré qu’à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration diminuait et le diamètre moyen augmentait.
Les mesures représentatives des absorbants de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30% sont montrées. Cela a montré que les assemblages intacts ont des propriétés optiques différentes, reflétées par des pics différents par rapport aux composants lipidiques individuels non assemblés. Des mesures de floraison représentatives de l’échantillon de microbulles pré-condensées et de gouttelettes post-condensées avec 30% de pyro-lipide sont présentées ici, démontrant différents pics de fluorescence pour des échantillons intacts sous la forme perturbée.
Des images échographiques représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30% imagées à différentes pressions sont montrées. À basse pression, seul le signal de fond des bulles d’air bloquées par la synthèse de la gélose a été observé. À une puissance légèrement supérieure, quelques microbulles ont été générées, ce qui est démontré par l’apparition de mouchetures brillantes.
Plus de microbulles ont été générées à mesure que la pression augmentait. Il est important de se rappeler que la température de condensation ici est optimisée pour cette formulation spécifique de coquille de gouttelettes. Différentes formulations de coquilles peuvent nécessiter une température différente.
