Ce protocole décrit le système de dimérisation chimique pour induire des condensats de protéines sur les télomères. Il peut être facilement adapté pour induire des condensats sur d’autres loci génomiques, et convient pour sonder la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine. Cette méthode offre la résolution temporelle requise pour l’imagerie des cellules vivantes et maintient la séparation de phase dans la population de cellules pour les essais biochimiques.
Pour commencer, dissoudre les dimériseurs dans le DMSO à 10 millimolaires et les stocker dans des tubes de microcentrifugation en plastique à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Diluer une aliquote de dimériseur de 10 millimolaires dans un milieu imageur jusqu’à une concentration en stock de 10 micromolaires et la stocker à moins 20 degrés Celsius. Lorsqu’ils sont prêts à l’emploi, diluez les dimériseurs à une concentration de travail finale de 100 nanomolaires dans un milieu de croissance ou un milieu d’imagerie.
Ensemencez les cellules de 10 à la cinquième dans des verres à couverture circulaire de 12 millimètres de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à six puits. Ensuite, transfectez les cellules avec les plasmides mutants Halo-GFP-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDFR-SIM et attendez 24 à 48 heures avant de procéder à l’immunofluorescence. Ajouter les 100 dimériseurs nanomolaires dilués aux cellules et les incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures.
Après l’incubation, fixer les cellules dans une solution de PBS contenant 4% de formaldéhyde et 0,1% de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS. Le couvercle de lavage glisse deux fois avec 50 microlitres de TBS-Tx et une fois avec 50 microlitres de tampon de dilution d’anticorps.
Incuber chaque couvercle avec 50 microlitres d’anticorps primaires anti-PML, anti-SUMO-1 ou anti-SUMO-2 et 3 à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée pendant la nuit. Le couvercle de lavage glisse trois fois avec un tampon de dilution d’anticorps pour éliminer l’anticorps primaire non lié, puis incube les cellules avec un anticorps secondaire pendant une heure dans une boîte sombre à température ambiante. Après la coloration, le couvercle de lavage glisse trois fois avec TBS-Tx.
Étiquetez les diapositives en ajoutant deux microlitres d’un microgramme par millilitre de DAPI, puis retournez les glissements de couvercle et placez-les sur la goutte de DAPI. Aspirer le liquide supplémentaire du bord du couvercle. Scellez la glissière avec du vernis à ongles, laissez-la sécher et rincez le haut du couvercle avec de l’eau.
Placez les lames au congélateur jusqu’à l’imagerie. Ensemencez 10 à la cinquième cellule sur des verres à couverture circulaire de 12 millimètres recouverts de Poly-D-Lysine dans une plaque à six puits et transfectez-les avec des plasmides mutants Halo-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM. Fixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les quatre fois avec du PBS.
Pour IF-FISH, colorez les cellules avec des anticorps primaires et secondaires et refixez-les avec du formaldéhyde à 4% pendant 10 minutes à température ambiante, puis lavez-les quatre fois avec du PBS et déshydratez les glissières de couverture dans une série d’éthanol. Incuber les glissements de couverture avec la sonde C-PNA de 488 télomères dans cinq microlitres de solution d’hybridation à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis incuber les glissements de couverture pendant la nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante. Lavez les couvercles trois fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes par lavage à température ambiante et montez-les avec un microgramme par millilitre DAPI dans un support de montage pour l’imagerie.
Pour l’imagerie en direct, montez les glissières de couverture dans des chambres magnétiques sur une scène chauffée dans une chambre environnementale, en maintenant les cellules dans un millilitre de milieu d’imagerie sans rouge phénol. Installez le microscope et l’appareil de contrôle de l’environnement comme décrit dans le manuscrit du texte. Localiser les cellules avec un signal GFP lumineux sur les télomères et un signal diffusif mCherry dans le cytosol.
Trouvez environ 20 cellules, mémorisez chaque position avec les informations XYZ et configurez les paramètres pour l’imagerie time-lapse. Utilisez un espacement de 0,5 micromètre pour un total de huit micromètres en Z et un intervalle de temps de cinq minutes pendant deux à quatre heures pour les canaux GFP et mCherry. Utilisez 30% de 594 nanomètres et 50% d’intensité de puissance de 488 nanomètres, avec des temps d’exposition de 200 millisecondes et un gain de caméra de 300.
Commencez l’imagerie et prenez une boucle temporelle comme pré-dimérisation. Ensuite, mettez l’imagerie en pause, ajoutez 0,5 millilitre de support d’imagerie contenant 15 microlitres de 10 dimériseurs micromolaires à la chambre d’imagerie, en prenant soin de ne pas toucher la scène, et reprenez l’imagerie. Lorsque vous êtes prêt à inverser la dimérisation, suspendez l’imagerie et ajoutez 0,5 millilitre de support d’imagerie contenant deux microlitres de TMP stock de 100 millimolaires à la chambre d’imagerie.
Continuez à imager les cellules pendant une à deux heures. Pour l’imagerie fixe, utilisez la même configuration de microscope que l’imagerie en direct, mais sans chauffage de la scène. Localisez environ 30 à 50 cellules avec le signal rouge à sélectionner pour les cellules transfectées.
Acquérir des images avec un espacement de 0,3 micromètre pour un total de huit micromètres dans Z.Utilisez 80% de 647 nanomètres, 80% de 561 nanomètres et 70% d’intensité de puissance de 488 nanomètres, avec des temps d’exposition de 600 millisecondes et un gain de caméra de 300. La localisation télomérique de SUMO a été identifiée à l’aide de l’ADN télomère FISH et de l’immunofluorescence de la protéine SUMO. Les cellules avec recrutement SIM enrichissaient SUMO-1 et SUMO-2 et 3 par rapport aux cellules avec recrutement de mutants SIM, ce qui indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM.
Un film en accéléré de TRF-1 et SIM après dimérisation est montré ici. Sim a été recruté avec succès pour les télomères, et les foyers SIM et TRF-1 sont devenus plus grands et plus lumineux, comme prévu pour la formation et la croissance de gouttelettes liquides. En outre, la fusion des foyers TRF-1 a été observée, ce qui a conduit à un regroupement des télomères, comme le montre la réduction du nombre de télomères et l’augmentation de l’intensité des télomères au fil du temps.
En revanche, le mutant SIM a été recruté pour les télomères après dimérisation, mais n’a induit aucune formation de gouttelettes ou de regroupement de télomères, ce qui indique que la séparation de phase et le regroupement des télomères sont entraînés par les interactions SUMO-SIM. L’inversion de la séparation de phase et du regroupement des télomères a été observée après l’ajout d’un excès de TMP libre. Le nombre de télomères a augmenté et l’intensité des télomères a diminué au fil du temps.
Des images représentatives des APM identifiés par l’ADN télomère FISH et la protéine PML IF sont montrées ici. Les cellules avec SIM recruté ont plus d’APN que les cellules avec un mutant SIM recruté, ce qui suggère que les condensats induits par la dimérisation sont en effet des APN. Lors de l’exécution de ce protocole, n’exposez pas les dimériseurs sensibles à la lumière à la lumière.
Travaillez dans une pièce sombre avec une lampe qui émet de la lumière rouge et enveloppez les cellules avec du papier d’aluminium pendant l’incubation. En suivant cette procédure, l’étiquetage de proximité peut être utilisé pour générer une liste complète des composants du condensat induit. L’imagerie en direct peut être utilisée pour suivre la dynamique des composants dans le condensat.
Ces méthodes peuvent aider à déterminer les rôles de la gouvernance du contrôle de la composition des condensats.
