Ce protocole est important car il détaille comment générer rapidement de grandes quantités de gabarit d’ADN à utiliser dans des réactions sans cellule à partir d’un petit fragment de gène reçu d’une installation de synthèse. L’amplification en cercle roulant peut générer de grandes quantités d’ADN plus rapidement que le clonage traditionnel. Il prend donc en charge les cycles de test de conception et de construction à haut débit à partir de bibliothèques d’ADN synthétique.
Ces techniques peuvent avoir une grande variabilité inhérente pour les nouveaux utilisateurs en raison des nombreuses étapes et des petits volumes requis. Une attention particulière doit être accordée à la technique, et la pratique rend parfait. Pour commencer, ajoutez tous les composants d’un kit PCR dans un seul tube PCR.
Ajoutez ensuite un microlitre du fragment de gène remis en suspension. Homogénéiser doucement le mélange en vortexant sur un réglage moyen pendant cinq à 10 secondes. Après avoir programmé le thermocycleur selon le protocole du fabricant du kit, exécutez la PCR.
Une fois la PCR terminée, utilisez un kit de nettoyage PCR pour purifier l’ADN du mélange réactionnel. Dans un tube de 1,5 millilitre, ajoutez le tampon de liaison à l’ADN et l’échantillon de PCR à un rapport de cinq pour un. Transférer ce mélange dans la colonne de spin et centrifuger à 16 000 fois G pendant une minute.
Jetez le flux à travers. Ajoutez 200 microlitres du tampon de lavage d’ADN à la colonne et incubez-le à température ambiante pendant une minute. Centrifugez à nouveau la colonne et jetez l’écoulement.
Lavez la colonne une fois de plus avec le tampon de lavage de l’ADN, comme démontré. Après avoir éliminé l’écoulement du deuxième lavage, retirez tout tampon restant en centrifugant la colonne pendant une à deux minutes supplémentaires. Pour éluer l’ADN, transférez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.
Ajoutez ensuite 46 microlitres d’eau double distillée dans la colonne. Après une incubation d’une minute, prélever l’ADN dans le tube par centrifugation. Et quantifier l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
Pour digérer et circulariser l’ADN, combinez cinq microlitres du tampon de réaction nécessaire, 20 unités de l’enzyme de restriction HindIII et 45 microlitres de l’ADN purifié dans un tube pcR. À l’aide d’une pipette, homogénéiser doucement ce mélange. Ensuite, incubez-le dans un thermocycleur pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.
Une fois l’incubation terminée, la chaleur inactive l’enzyme HindIII en incubant pendant 20 minutes à 80 degrés Celsius. Ajoutez ensuite cinq microlitres de tampon T4 Ligase et 800 unités de T4 Ligase à l’ADN nouvellement digéré. Après avoir mélangé doucement avec une pipette, incuber le mélange pendant une heure à 25 degrés Celsius pour effectuer la réaction de circularisation.
Une fois la réaction terminée, purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR comme démontré précédemment. Ensuite, quantifiez l’ADN. Pour effectuer l’amplification du cercle de roulement, combinez tous les composants de réaction et un microlitre du gabarit d’expression circularisé purifié dans un seul tube.
Homogénéiser le mélange avec une pipette et aliquoter 10 microlitres du mélange en quatre tubes séparés. Incuber les tubes à 30 degrés Celsius pendant quatre à 18 heures, puis inactiver l’enzyme à la chaleur en incubant à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’inactivation de la chaleur, encouragez la condensation au fond du tube en incubant à 12 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, diluez la solution obtenue en ajoutant 15 microlitres d’eau double distillée à chaque tube. Combinez le contenu de chaque tube avant de purifier et de quantifier l’ADN comme démontré précédemment. Pour effectuer la réaction sans cellule, ajoutez les différents composants requis dans un tube et diluez au volume final souhaité avec de l’eau distillée en double.
Mélangez soigneusement la solution en pipetant la moitié de la solution de haut en bas 10 à 20 fois. Transférer le mélange réactionnel dans des aliquotes de 15 microlitres dans les puits souhaités dans la plaque de microtitrage. Ensuite, scellez la plaque avec un film d’étanchéité incolore pour maintenir l’humidité et empêcher l’évaporation.
Placez la plaque scellée dans le lecteur de plaque et laissez la réaction se terminer. Si vous exprimez le gène BPN de la subtilisine à l’aide du système sans cellule, aliquotez 94 microlitres d’eau double distillée et un microlitre de 10 micromolaires PNA dans une plaque de 96 puits à fond plat et incolore. Ajoutez ensuite cinq microlitres de la réaction sans cellule terminée et lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque réglé pour mesurer l’absorbance à 410 nanomètres toutes les 20 secondes pendant 10 minutes tout en maintenant une température de 25 degrés Celsius.
L’expression du Superfolder GFP dans l’extrait d’étoile BL21 DE3 en utilisant seulement 3 microlitres d’ADN RCA non purifié dans une réaction de 15 microlitres est comparable à celle du plasmide PJL1. Doubler et tripler les quantités de gabarit ne semble offrir aucun avantage évident, suggérant des niveaux déjà saturés du gabarit à 3 microlitres par réaction. Inversement, il semble y avoir un avantage à augmenter la quantité de modèle RCA lors de l’utilisation de l’extrait de cellule de souche shuffle.
Les protéines nécessitant des températures plus basses ou des temps de pliage plus longs affectent le temps nécessaire pour terminer l’ensemble du flux de travail. Par exemple, le dosage de la subtilisine après quatre heures d’expression conduit à un résultat raté, car quatre heures ne suffisent pas pour la maturation de la subtilisine. Cependant, permettre à la réaction de se poursuivre pendant 16 heures conduit à des niveaux détectables de subtilisine.
Tous les composants doivent être bien mélangés pour que ce protocole fonctionne avec une efficacité maximale. En suivant ces méthodes, une grande bibliothèque de protéines candidates peut être générée synthétiquement, puis exprimée à un rendement suffisant pour la caractérisation. Cette méthode a ouvert la voie à notre groupe pour développer N C deux capteurs qui peuvent fonctionner dans des extraits cellulaires, nous permettant de caractériser rapidement la protéine prototype.
Cela nous permettra d’itérer plus rapidement et plus intelligemment sur la conception de protéines de nouveaux biocatalyseurs et thérapies.
