Notre protocole pour l’expression des protéines sans cellules utilise de l’extrait brut très actif de la bactérie à croissance rapide Vibrio natriegens, qui est préparé à l’aide d’un processus simple et efficace en deux étapes de sonication-centrifugation. La préparation de l’extrait de cellules brutes et la synthèse de protéines sans cellules peuvent être réalisées en un à deux jours par un seul utilisateur permettant à cette technique d’être facilement intégrée dans les pipelines pour des applications de bioproduction ou de biologie synthétique. Pour commencer à laver un millilitre de la nuit Vibrio natriegens culture en le centrifugant dans une centrifugeuse benchtop à 10, 600 fois g pendant une minute.
Aspirez le supernatant sans déranger la pastille, et résuspendez en un millilitre de médias LB-V2 frais. Inoculer un millilitre de culture de nuit lavée dans un litre de liquide frais de croissance LB-V2 dans un autoclavé de quatre litres déconcerté flacon Erlenmeyer avec couvercle stérile pour atteindre une à mille ration de dilution. Cultivez la culture à 30 degrés Celsius tout en secouant à 225 RPM.
Utilisez un spectrophotomètre pour surveiller les cultures OD 600. Et quand il atteint 1,0 plus ou moins 0,2 récolte la culture en la centrifugant dans deux tubes de 500 millilitres à 3500 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis placer sur la glace. Aspirer le surnatant et traiter la pastille immédiatement.
Avant de commencer la procédure de lyse cellulaire refroidir fraîchement préparé S30 lysis tampon pH 7,7 à environ quatre degrés Celsius, Utilisez 10 millilitres de ce tampon froid de lyse S30 pour re-suspendre toutes les granulés résultant de la même culture d’un litre. Et transférer la suspension dans un tube de 50 millilitres. Centrifugez cette suspension à 3500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis aspirez le supernatant sans déranger la pastille et placez-la sur la glace.
En travaillant dans une pièce froide, ajouter 500 microlitres de tampon de lyse S30 froid à la pastille dans le tube de 50 millilitres placé sur la glace. Utilisez une pointe de pipette à alésage large pour résuspendre la pastille et la transférer soigneusement dans un tube de deux millilitres également sur la glace. Afin de produire des extraits bruts très actifs, nous devons nous assurer que les cellules ne sont pas sur diluées avec le tampon S30, mais ont suffisamment de liquide pour une sonication efficace.
Remplissez un bécher de 600 millilitres de glace et placez un support de tube de deux millilitres sur la glace. Vortex le tube brièvement pour homogénéiser les cellules. Feuilletez pour enlever toutes les cellules sur le fond du bouchon, et placez-les dans le support de tube avec le chapeau ouvert.
Bas de la pointe du sonicateur dans la suspension cellulaire dans le tube de sorte qu’il est juste sous la surface liquide. Préparez la mise en place de la sonication à l’aide d’un sonicateur et d’une sonde d’un diamètre de pointe de 1/8 pouce. Réglez le sonicateur à 20 kilohertz de fréquence et 50% d’amplitude.
Temps d’impulsion de 10 secondes et temps d’impulsion de 60 secondes. Exécutez le protocole de sonication des impulsions pendant trois cycles. Et puis centrifugeuse extrait de cellules brutes à 16 000 fois g pendant 30 à 45 minutes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le lysate soit exempt de débris cellulaires.
Il est essentiel d’inspecter visuellement la lyse cellulaire à mesure que la sonication a lieu pour s’assurer que la sonication a fonctionné comme prévu. Travailler dans une chambre froide aliquot 50 microlitres des supernatants résultants à de nouveaux tubes de deux millilitres en s’assurant de ne pas déranger la pastille. Pour congeler flash ces extraits de cellules brutes placer les tubes dans un support de tube avec une corde de trempage attaché et plonger dans une dewar contenant de l’azote liquide et vérifier si congelés.
Pour effectuer l’expression des protéines sans cellules à l’aide du modèle d’ADN décongeler 10X mélange maître solution énergétique, 4X acides aminés maître mélange aliquots, et modèle d’ADN à température ambiante. Retirez ensuite les stocks d’inhibiteurs de l’ARN T7 et du RNAse du congélateur de moins 20 degrés Celsius et placez-les sur la glace. Une fois le modèle d’ADN, le mélange maître de solution énergétique 10X et le mélange maître des acides aminés 4X sont décongelés, placez-les sur de la glace.
Préparez un mélange maître de réaction sans cellule en ajoutant chaque composant dans l’ordre précis à un tube de deux millilitres sur la glace, et faites glisser doucement le tube après chaque ajout au mélange principal. Retirer le lysate brut Vibrio natriegens du congélateur de moins 80 degrés Celsius et le placer sur la glace pendant 10 à 20 minutes jusqu’à ce qu’ils soient décongelés. Ajouter le volume approprié d’extrait brut décongelé de cellules au mélange maître de réaction sans cellules et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette.
Pour effectuer l’expression des protéines sans cellules de point de terminaison à l’aide du thermocycleur, ajoutez d’abord 10 microlitres du mélange maître de réaction sans cellules par puits du fond d’une plaque PCR de 96 puits en vous assurant de mélanger le mélange principal en faisant glisser doucement le tube entre chaque transfert à la plaque PCR. Centrifugeuse la plaque à 1000 fois g pendant 10 secondes pour mettre en commun tout mélange maître qui aurait pu être collé sur les côtés des puits. Et puis sceller les puits avec un adhésif plaque pour empêcher l’évaporation.
Placez la plaque dans un thermocycleur fixé à 26 degrés Celsius avec un couvercle chauffant fixé à 105 degrés Celsius. Après avoir incubé les réactions dans la plaque PCR pendant au moins trois heures, les protéines exprimées peuvent être purifiées, quantifiées et utilisées pour les processus en aval. Pour surveiller la cinétique d’expression protéique sans cellules à l’aide d’une pipette de lecteur de plaques 10 microlitres par puits du mélange maître de réaction sans cellules au fond d’une plaque noire d’analyse de 384 puits avec des fonds de verre clairs.
Et sceller les puits avec un adhésif de plaque claire pour empêcher l’évaporation. Placez la plaque d’essai dans un lecteur de plaque fixé à 26 degrés Celsius et incubez pendant trois à six heures tout en surveillant les longueurs d’onde fluorescentes/d’émission appropriées correspondant à la protéine exprimée. Système d’expression sans cellules décrit dans ce protocole obtenir les meilleurs résultats avec modèle d’ADN plasmide donnant une quantité significativement plus élevée de protéines que la même quantité d’ADN linéaire que montré par le point final et les analyses cinétiques.
L’ARNm généré par des réactions de transcription in vitro pourrait également être utilisé, mais des quantités plus élevées d’ARNm sont nécessaires. Le rendement de la production de protéine a été sensiblement affecté par la concentration des ions de magnésium et de potassium. Dans des conditions optimisées, la concentration optimale d’ion de magnésium s’est trouvée à 3,5 millimolar et pour l’ion de potassium, 80 millimolar.
Ainsi, les écarts par rapport à ces concentrations optimales d’ion peuvent entraîner une diminution de la capacité de ce système d’expression à produire des rendements significatifs de protéines. Il est important de garder tous les reagents sur la glace ou de travailler dans une chambre froide autant que possible. En outre, une sonication appropriée et complète est essentielle au succès de ce protocole.
Suivant ce protocole, les utilisateurs auront la capacité d’exprimer des protéines dans un format à haut débit, qui peut être utilisé pour purifier et dépister l’activité de nombreuses protéines différentes. Cette technique démontre l’utilisation de nouveaux organismes aux propriétés uniques pour la libre expression cellulaire. Vibrio natriegens est une bactérie halophile à croissance rapide qui peut offrir des conditions uniques pour l’expression de protéines ou de petites molécules auparavant inexplorées dans les organismes modèles établis.
