Notre méthode permet la caractérisation rapide de parties génétiques à l’aide de systèmes d’expression sans cellules et de PCR au lieu du clonage. Le principal avantage de cette technique est que ce qui prend généralement des jours à des semaines dans les cellules peut être fait en heures à jours en utilisant cette méthode. Notre protocole comprend des étapes pour créer vos propres systèmes d’expression sans cellule, ce qui peut être délicat à plusieurs endroits et peut nécessiter des ajustements en fonction du cas d’utilisation.
Lorsque vous débutez, nous vous recommandons de commencer avec des kits commerciaux. Commencez par préparer le mélange maître PCR selon les instructions du manuscrit et conservez-le sur de la glace. Aliquote 30 ou 40 microlitres du mélange principal dans le nombre déterminé de tubes PCR et ajouter 10 microlitres de chaque cinq amorces variables micromolaires aux tubes PCR correctement étiquetés.
Placez les tubes de PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme de PCR comme mentionné dans le manuscrit texte. Ensuite, maintenez les réactions à quatre degrés Celsius. Si la matrice originale est de l’ADN plasmatique, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction DpnI pour digérer la matrice originale et incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Analysez cinq microlitres de chaque produit PCR en les séparant à l’aide d’un gel d’agarose à 1% à 180 volts pendant 20 minutes. Vérifiez la taille de bande correcte, qui variera en fonction de la séquence de noyau choisie et de la longueur des pièces ajoutées. Purifiez les gabarits linéaires à l’aide d’un kit de purification PCR commercial.
Si plusieurs bandes étaient présentes par électrophorèse sur gel, exciser les bandes d’intérêt du gel et purifier l’ADN à l’aide d’une trousse d’extraction de gel commerciale, conformément aux instructions du fabricant. Quantifier chaque matrice d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre, en évaluant sa qualité en vérifiant que le rapport de 260 à 280 nanomètres est d’environ 1,8. Décongeler tous les composants sur la glace et préparer un mélange maître en mélangeant soigneusement tous les composants à l’aide d’une pipette, comme mentionné dans le manuscrit.
Portez une attention particulière pour éviter les précipitations, en particulier pour le mélange d’acides aminés. Conserver le mélange principal sur la glace. Refroidir une plaque de 384 puits sur de la glace et répartir le mélange principal en aliquotes de neuf microlitres dans chaque puits.
Décongeler la protéine répressive sur la glace et la répartir dans une plaque source acoustique de manipulation de liquide, en veillant à ce que la quantité appropriée de volume mort requise pour le type de plaque source utilisée soit incluse. Distribuez la protéine répressive dans des volumes d’un microlitre dans les puits de destination appropriés via le manipulateur de liquide. Inclure une dilution en série du rapporteur purifié ou un étalon chimique approprié sur la plaque pour comparer les résultats avec ceux d’autres études et d’autres laboratoires.
Choisissez une plage de concentrations appropriée pour le rapporteur utilisé dans la plage d’expression attendue des expériences. Préchauffez le lecteur de plaques à 30 degrés Celsius. Si possible, sur l’instrument, réglez un gradient vertical de température d’un degré Celsius pour limiter la condensation sur le joint.
Réglez le lecteur de plaques pour qu’il lise aux réglages appropriés pour le rapporteur utilisé dans la séquence principale, sans trembler les étapes. Scellez la plaque de 384 puits avec un joint en plastique imperméable pour empêcher l’évaporation. Placez la plaque de 384 puits sur le support de plaque et commencez la lecture.
15 modèles linéaires, variant uniquement par la distance du promoteur T7 par rapport à la séquence tetO, ont été préparés par PCR, amplifiant le rapporteur de protéines fluorescentes vertes superdossier, avec des amorces conçues pour ajouter chaque variante du promoteur. L’analyse des données d’un total de 540 réactions pour l’ensemble des combinaisons T7 tetO a montré que l’ARN T7 polymérase régule à la baisse l’expression T7 pilotée par T7, jusqu’à 13 paires de bases en aval du début du transcrit T7. Une distribution plus uniforme dans la série de huit puits de destination à l’aide du manipulateur de liquide acoustique a été observée lorsqu’un transfert de cinq microlitres a été divisé en distributions distinctes d’un microlitre.
Notre protocole peut être utilisé pour cribler rapidement des composants génétiques, que ce soit pour le criblage de nouveaux biocapteurs ou la construction de bibliothèques de pièces génétiques.
