Ce protocole simple permet d’étiqueter les VE et de les surveiller par microscopie confocale. Par exemple, l’imagerie des VE pourrait aider à évaluer la distribution des VE lorsqu’elle est utilisée dans des thérapies. Cette technique permet de surveiller facilement la migration et l’absorption des VE dans les explants cartilagineux, avec la microscopie confocale sans fonction particulière.
Le même protocole peut être utilisé pour les VE pour des expériences in vitro ou in vivo. Assurez-vous que les colonnes sont préparées à l’avance et que le volume initial des véhicules électriques est suffisant pour atteindre la concentration finale de particules souhaitée, étant donné qu’environ 10% des particules seront perdues lors de l’étape de purification. Commencez par concentrer l’échantillon de vésicule extracellulaire, ou EV, et le témoin.
Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 millilitres ou 500 microlitres, selon le volume de départ de l’échantillon EV. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec. Remettez en suspension les échantillons EV concentrés avec 200 microlitres et le groupe témoin avec 100 microlitres de diluant C, et transférez-les dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 millilitre.
Séparez l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 microlitres chacune. Marquez l’une des aliquotes avec du colorant et utilisez-la comme traitement. Laissez l’autre non marqué, mais traitez-le comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par analyse de suivi des nanoparticules.
Préparer 2x solution de colorant de telle sorte que la concentration résultante de la solution de PKH26 dans le diluant C soit de huit micromolaires. Mélanger un microlitre d’un millimolaire PKH26 par 125 microlitres de diluant C dans l’échantillon. Préparez le volume requis pour ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.
Ajouter 2x solution de colorant aux VE dérivés du lysat plaquettaire PKH et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1, pour obtenir une concentration de colorant de 1x et quatre concentrations de PKH26 micromolaires. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon de VE dérivé du lysat plaquettaire NTA. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ajouter 5% de solution d’albumine-PBS sérique bovine aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 microlitres. Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions de colorant non spécifique avec la colonne. Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 microlitres de VE dérivés du lysat plaquettaire PKH, de VE dérivés du lysat plaquettaire NTA, ou contrôlez et jetez tout liquide élué.
Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 microlitres de PBS et jeter tout le liquide élué. Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
Ajouter 600 microlitres de PBS et recueillir une fraction de 600 microlitres dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour une nouvelle colonne, répétez les étapes impliquant la concentration des échantillons mentionnés au début du protocole. Ajoutez 600 microlitres de véhicules électriques précédemment élués à la colonne et jetez le volume élué.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de PBS et jetez tous les volumes élués. Ajoutez 600 microlitres de PBS à la colonne et collectez une fraction de 600 microlitres dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre. Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de trois millimètres de diamètre dans des conditions stériles.
Placez les explants dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12, complété par 1% de streptomycine de pénicilline à 37 degrés Celsius, 5% de CO2 et 80% d’humidité. Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 nanogrammes par millilitre d’oncostatine M et deux nanogrammes par millilitre de facteur de nécrose tumorale-alpha. Traiter les explants avec 1 fois 10 à 9ème particules par puits de VE dérivés du lysat plaquettaire PKH, ou de contrôle, dans un milieu de culture cellulaire complété par l’oncostatine M et le facteur de nécrose tumorale-alpha.
Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajoutez 200 microlitres du milieu de culture cellulaire à chaque puits comme décrit dans le manuscrit. Arrêtez le test in vitro toutes les heures de zéro à cinq heures.
Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 microlitres de PBS. Ajouter 100 microlitres de 4% de paraformaldéhyde au tissu pour le fixer pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Retirez le PFA, ajoutez 100 microlitres de PBS, stockez le tissu fixe à quatre degrés Celsius et traitez les échantillons dans les 48 heures.
Les images prises à différents moments montrent comment les VE pénètrent dans le tissu jusqu’à ce qu’ils atteignent les chondrocytes et pénètrent dans les chondrocytes au fil du temps. Les VE marqués étaient déjà localisés autour des chondrocytes après une heure d’incubation. Assurez-vous que le volume initial des véhicules électriques est suffisant pour atteindre la concentration finale de particules souhaitée.
Une autre chose importante à retenir est d’utiliser les véhicules électriques étiquetés dans les prochaines 24 heures. Si vous ne l’utilisez pas dans les 24 heures, une diminution de la fluorescence peut se produire. Cette technique aidera les chercheurs à améliorer l’imagerie des VE et à étudier les VE en biologie et en thérapeutique.
