פרוטוקול פשוט זה מאפשר לתייג EVs ולנטר אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לדוגמה, הדמיית EV עשויה לסייע בהערכת התפלגות EV בעת השימוש בו טיפולית. טכניקה זו מאפשרת לעקוב אחר נדידת EV וספיגה explants סחוס בקלות, עם מיקרוסקופיה confocal ללא כל פונקציה מיוחדת.
אותו פרוטוקול יכול לשמש עבור EVs עבור במבחנה או ניסויים ב- vivo. ודא כי העמודים מוכנים מראש, וכי הנפח הראשוני של EVs מספיק כדי להגיע לריכוז החלקיקים הסופי הרצוי, בהתחשב בכך סביב 10% של החלקיקים יאבדו במהלך שלב הטיהור. התחל על ידי ריכוז ההדבקה החוץ-תאית, או EV, מדגם ואת הפקד.
מניחים את הדגימות בצינור ריכוז של 15 מיליליטר או 500 מיקרוליטרים, בהתאם לנפח ההתחלתי של דגימת EV. צנטריפוגות הצינורות על פי הוראות היצרן עד לקבלת דגימה כמעט יבשה. להשעות מחדש את דגימות EV מרוכז עם 200 microliters, ואת קבוצת הביקורת עם 100 microliters של דילול C, ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר חדש.
הפרד את דגימת EV לשני aliquots של 100 microliters כל אחד. סמן את אחד המזונות בצבע והשתמש בו כטיפול. השאר את השני לא מסומן, אבל לעבד אותו כמו מדגם EV, ולהשתמש בו כדי לכמת את ריכוז EV על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים.
הכן פתרון צבע 2x, כך הריכוז המתקבל של פתרון PKH26 בדילול C הוא שמונה מיקרומולר. מערבבים מיקרוליטר אחד של מקשר PKH26 מילימטרי לכל 125 מיקרוליטרים של דילול C במדגם. הכן את אמצעי האחסון הדרוש להוספה לדגימות ביחס של 1:1.
הוסיפו תמיסת צבע 2x לרכבים EVs שמקורם בטסיות PKH ודגימות בקרה ביחס של 1:1, כדי להשיג ריכוז צבע 1x, וארבעה מיקרומולרים PKH26 ריכוז. הוסף את אותו נפח של PBS לדגימת EV נגזרת LYSATE טסיות NTA. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 5%פתרון אלבומין-PBS בסרום בקר לדגימות ביחס של 1:1, וודא שהנפח הסופי הוא כ-400 מיקרוליטרים. המשך להפריד את ה- EVs המסומנים בתווית מאינטראקציות הצבע הלא מאוגדות והצבע הלא ספציפי עם העמודה. הסר את המכסה מהעמודה, הוסף 400 מיקרוליטרים של טלוויזיות EV שמקורן בטסיות PKH, EVs שמקורם בטסיות NTA, או בקר והשלכת כל הנוזלים הנגזרים.
המתן עד שהדוגמה תוזן בעמודה לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של PBS ומשליכים את כל הנוזלים הנבהים. המתן עד שה- PBS יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
הוסף 600 מיקרוליטרים של PBS ואסוף שבריר של 600 מיקרוליטרים בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. עבור עמודה חדשה, חזור על השלבים הכרוכים בריכוז הדגימות שהוזכרו בתחילת הפרוטוקול. הוסף 600 מיקרוליטרים של EVs שנבהרו בעבר לעמודה ומחק את אמצעי האחסון הנבה.
לאחר מכן להוסיף 400 microliters של PBS ולהשליך את כל הכרכים הנבהרים. הוסף 600 מיקרוליטרים של PBS לעמודה ואסוף שבריר של 600 מיקרוליטרים בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לשטוף את הסחוס פעמיים עם PBS ולבלום אותו באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר שלושה מילימטר בתנאים סטריליים.
מניחים את explants בצלחות תרבות 96-טוב עם בינוני DMEM-F12, בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, ו 80% לחות. כדי להקים מודל OA מונע דלקת, להשלים את המדיום תרבית התא עם 10 ננוגרם למיליליטר של אונקוסטטין M ושני ננוגרם למיליליטר של גורם נמק הגידול-אלפא. לטפל explants עם 1 פעמים 10 עד 9 חלקיקים לכל באר של PKH טסיות ליסאט נגזר EVs, או שליטה, במדיום תרבית התא בתוספת אונקוסטטין M וגורם נמק הגידול-אלפא.
מוציאים את המדיום מלוחות תרבית התאים 96-well המכילים explants סחוס. הוסף 200 מיקרוליטרים של המדיום תרבית התא לכל טוב כפי שתואר בכתב היד. עצור את מבחנה כל שעה מאפס לחמש שעות.
לשטוף את בארות תרבית התא המכיל את explants הסחוס פעמיים עם 200 microliters של PBS. הוסף 100 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde לרקמה כדי לתקן את זה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את PFA, להוסיף 100 microliters של PBS, לאחסן את הרקמה הקבועה בארבע מעלות צלזיוס, ולעבד את הדגימות בתוך 48 שעות.
תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות מראות כיצד EVs נכנסים לרקמה עד שהם מגיעים chondrocytes, ולהכניס chondrocytes לאורך זמן. כלי ה-EV המסומנים כבר היו מקומיים סביב כונדרוציטים לאחר שעה של דגירה. ודא כי הנפח הראשוני של EVs מספיק כדי להגיע לריכוז החלקיקים הסופי הרצוי.
דבר חשוב נוסף שיש לזכור הוא להשתמש ב- EVs המסומן ב -24 השעות הקרובות. אם לא להשתמש בו בתוך 24 שעות, ירידה פלואורסצנטיות עלולה להתרחש. טכניקה זו תסייע לחוקרים לשפר את הדמיית EV, וללמוד EVs בביולוגיה וטיפולים.
