이 간단한 프로토콜은 EV에 레이블을 지정하고 공초점 현미경 검사를 통해 모니터링 할 수 있습니다. 예를 들어, EV 이미징 치료에서 사용할 때 EV 분포를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 특별한 기능없이 공초점 현미경 검사법을 사용하여 연골 이외에도 연골 의 EV 마이그레이션 및 섭취를 쉽게 모니터링 할 수 있습니다.
동일한 프로토콜은 시험관 내 또는 생체 내 실험용 EV에 사용할 수 있습니다. 입자의 약 10%가 정화 단계에서 손실될 것이라는 점을 고려하여 기둥이 미리 준비되고, 전기의 초기 부피가 원하는 최종 입자 농도에 도달하기에 충분했는지 확인하십시오. 세포 외 소포 또는 EV, 샘플 및 제어를 집중하여 시작합니다.
EV 샘플의 시작 부피에 따라 15 밀리리터 또는 500 마이크로리터 집중 튜브에 샘플을 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다. 농축 된 EV 샘플을 200 마이크로 리터로 다시 중단하고 100 마이크로 리터의 희석 C를 가진 대조군을 다시 중단하고 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 전송합니다.
EV 샘플을 각각 100마이크로리터의 두 개의 알리쿼트로 분리합니다. 염료로 알리쿼트 중 하나를 표시하고 치료로 사용하십시오. 다른 표시를 남기지 말고 EV 샘플처럼 처리하고 나노 입자 추적 분석에 의해 EV 농도를 정량화하는 데 사용합니다.
희석 C에서 PKH26 용액의 생성 농도가 8 마이크로몰어가 될 수 있도록 2배 염료 용액을 준비한다. 샘플에 희석 C의 125 마이크로리터 당 1 밀리 마일러 PKH26 링커의 마이크로 리터 1개를 혼합합니다. 1:1 비율로 샘플에 추가하는 데 필요한 볼륨을 준비합니다.
PKH 혈소판 용해 유래 전기자동차및 대조료에 2x 염료 용액을 1:1 비율로 첨가하여 1x 염료 농도, 4개의 마이크로몰라 PKH26 농도를 달성한다. NTA 혈소판 용해 유래 EV 샘플에 동일한 PBS 의 PBS 를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요.
1:1 비율로 샘플에 5%소 세럼 알부민-PBS 솔루션을 추가하고 최종 볼륨이 약 400 마이크로리터인지 확인합니다. 레이블이 지정된 EV를 언바운드 염료 및 열과의 비특이적 염료 상호 작용에서 분리합니다. 기둥에서 캡을 제거하고, PKH 혈소판 리사테 유래 EV, NTA 혈소판 리사테 유래 EV의 400 마이크로리터를 추가하거나, 모든 용출된 액체를 제어하고 폐기한다.
다음 단계로 진행하기 전에 샘플이 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS 의 600 마이크로 리터를 추가하고 모든 용출 액체를 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 PBS가 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다.
PBS의 600 마이크로 리터를 추가하고 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 600 마이크로 리터의 일부를 수집합니다. 새 열의 경우 프로토콜 시작 부분에 언급된 샘플의 농도와 관련된 단계를 반복합니다. 이전에 용출된 EV 600마이크로리터를 열에 추가하고 용출된 볼륨을 폐기합니다.
그런 다음 PBS의 400 마이크로 리터를 추가하고 모든 용출 된 볼륨을 폐기합니다. 600 마이크로리터의 PBS를 컬럼에 추가하고 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 600마이크로리터를 수집합니다. PBS로 연골을 두 번 세척하고 멸균 조건하에서 3밀리미터 직경의 생검 펀치를 사용하여 소비합니다.
DMEM-F12 배지로 96웰 배양 판에 이식하여 섭씨 37도, CO2 5%, 습도 80%로 보충합니다. 염증 중심의 OA 모델을 확립하려면 온코스타틴 M의 밀리리터당 10 나노그램, 종양 괴사 인자-알파의 밀리리터당 2나노그램으로 세포 배양 배지를 보완한다. 온코사틴 M 및 종양 괴사 인자-알파로 보충된 세포 배양 배지에서 PKH 혈소판 리사테 유래 EV 또는 대조군당 1회 10~9번째 입자로 이물질을 치료한다.
연골 이외에도 함유된 96웰 세포 배양 판에서 배지를 제거한다. 원고에 기재된 세포 배양 배지의 200마이크로리터를 각각 첨가한다. 체외 분석은 0에서 5 시간마다 중지합니다.
연골을 함유한 세포 배양 우물을 PBS 200 마이크로리터로 두 번 세척합니다. 조직에 4%의 파라포름알데히드100마이크로리터를 추가하여 섭씨 4도에서 3시간 동안 고치게 합니다. PFA를 제거하고, PBS 100 마이크로리터를 추가하고, 고정 조직을 섭씨 4도에 저장하고, 48시간 이내에 샘플을 처리합니다.
서로 다른 시점에서 찍은 이미지는 EV가 연골 세포에 도달하고 시간이 지남에 따라 연골 세포에 들어갈 때까지 조직에 어떻게 들어가는지 보여줍니다. 라벨이 부착된 전기 는 이미 1시간 동안 의배양 후 연골세포 주변에 국한되었다. 초기 EV 볼륨이 원하는 최종 입자 농도에 도달하기에 충분합니다.
기억해야 할 또 다른 중요한 점은 향후 24시간 이내에 레이블이 부착된 EV를 사용하는 것입니다. 24시간 이내에 사용하지 않으면 형광이 감소될 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 EV 영상을 개선하고 생물학 및 치료 분야에서 EV를 연구하는 데 도움이 될 것입니다.
