Les tests basés sur TR-FRET fournissent de nouveaux outils rentables pour le dépistage et la caractérisation pharmacologique des modulateurs spécifiques et sélectifs des voies de signalisation JAK/STAT. Cette technique est beaucoup plus facile, rapide, reproductible et robuste que les méthodes conventionnelles comme le Western blot et ELISA. Aucune étape de lavage n’est requise et les réactifs sont ajoutés en une seule étape.
Cette plateforme d’immunodosage peut être facilement appliquée à d’autres protéines de signalisation cellulaire à condition que des anticorps spécifiques soient disponibles. Pour concevoir des essais reproductibles, vous devez utiliser de bonnes pratiques de culture cellulaire et établir des procédures opérationnelles normalisées. De plus, vous devez optimiser soigneusement les conditions de culture cellulaire et de traitement.
Geneviève Chatel, une scientifique de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez des cellules HeLa et A431 dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone en utilisant du DMEM complété par 10% FBS. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, essayez-les et passez-les ou utilisez-les pour des essais.
Pour effectuer le test, distribuer 50 microlitres de cellules à la densité pré-optimisée dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits traitée dans le milieu de culture approprié, puis les incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, préparer les séries intermédiaires de dilution double et quadruple des composés d’essai en diluant en série le composé dans un milieu sans sérum sur 12 puits d’une plaque de polypropylène à 96 puits. Pour la stimulation cellulaire, ajoutez 50 microlitres de milieu sans sérum contenant le simulateur à une concentration de 2X et incubez les cellules pendant le temps pré-optimisé à température ambiante ou à 37 degrés.
Pour l’inhibition cellulaire, ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant l’inhibiteur à une concentration de 4X et incubez les cellules pendant le temps pré-optimisé à température ambiante ou à 37 degrés, puis ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant le stimulateur à une concentration de 4X et incubez pendant le temps pré-optimisé. Ensuite, pour lyser les cellules, préparez le tampon de lyse supplémenté 1X et ajoutez-y un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase. Après avoir soigneusement retiré et éliminé le milieu de culture cellulaire, ajouter immédiatement 50 microlitres du tampon de lyse 1X supplémenté préparé et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation modérée.
Pour la détection TR-FRET, préparez le mélange de détection d’anticorps 4X dans un tampon de détection 1X, puis préparez les solutions d’anticorps EUAB1 et FRAB2, ainsi que les solutions d’anticorps EUAB3 et FRAB4 dans un tampon de détection 1X. Enfin, mélanger EUAB1 pré-dilué avec FRAB2 pré-dilué pour la détection des phosphoprotéines et EUAB3 pré-dilué et FRAB4 pré-dilué pour la détection de protéines totales. Ensuite, pipetez soigneusement 15 microlitres de la cellule lysat de la plaque de culture de 96 puits vers un puits d’une microplaque blanche de 384 puits à faible volume.
Ensuite, ajoutez 15 microlitres du lysat témoin positif et 15 microlitres de tampon de lyse 1X comme témoin négatif pour séparer les puits d’essai. Aux puits contenant 15 microlitres de lysat, ajoutez cinq microlitres du mélange de détection d’anticorps 4X correspondant pour détecter la phosphoprotéine ou la protéine totale. Après avoir recouvert la plaque d’un scellant à plaques, incubez-la à température ambiante pendant une heure à toute la nuit en fonction du kit d’essai.
Une fois l’incubation terminée, retirez le scellant de plaque adhésive et lisez la plaque sur un lecteur de microplaques compatible TR-FRET. Les résultats des tests TR-FRET pour la détection et la quantification du phospho-STAT1 avec stat1 et phospho-STAT4 totaux dans les cellules U266B1 ainsi que du phospho-STAT5 avec stat5 total dans les cellules A431 sont représentés à l’aide de courbes de réponse de concentration. De même, les tests TR-FRET pour la détection et la quantification du phospho-STAT3 et du total STAT3 et du phospho-STAT6 et du total STAT6 dans les cellules HeLa sont représentés à l’aide de courbes de réponse de concentration.
Dans l’ensemble, tous les essais ont montré des signaux TR-FRET robustes, de larges plages dynamiques, une faible variation du coefficient entre les puits et des rapports signal/arrière-plan acceptables. Le traitement des cellules avec des activateurs JAK, de l’interféron alfa-2B et de l’IL-4 et de l’EGF a montré l’augmentation prévue de la phosphorylation STAT dépendante de la concentration à des résidus de tyrosine spécifiques, tandis que les protéines STAT totales correspondantes sont restées stables. L’inhibiteur de JAK et l’erlotinib ont tous deux inhibé les niveaux correspondants de phospho-STAT d’une manière dépendante de la concentration.
Les résultats de la stimulation phospho-STAT4 par l’interféron alfa-2B dans une lignée cellulaire en suspension ou de la stimulation phospho-STAT6 par l’IL-4 dans une lignée cellulaire d’adhérence à l’aide du protocole à une plaque étaient cohérents avec ceux obtenus à l’aide du protocole à deux plaques, montrant ainsi l’adaptabilité réussie d’un protocole de transfert à deux plaques à un protocole de puits tout-en-un à une plaque. Les résultats de l’étude de variabilité intra-plaque pour le test phospho-STAT1 utilisant une lignée cellulaire en suspension et le test phospho-STAT3 utilisant une lignée cellulaire d’adhérence démontrent la robustesse de ces tests phospho-STAT pour les applications HTS. Il est essentiel de compléter le tampon de lyse avec le cocktail d’inhibiteurs de phosphatase pour empêcher la déphosphorylation des protéines phosphorylées de la phosphatase active présente dans l’extrait de cellule entière.
