Ce protocole décrit un processus expérimental étape par étape et un algorithme mathématique pour quantifier FRET en utilisant la trempe du donneur et l’émission sensibilisée par accepteur. La quantification de l’efficacité FRET dans la cellule vivante nécessite de déterminer la diaphonie des protéines fluorescentes et les efficacités relatives d’émission et de détection des fluorophores dans la configuration microscopique. La diaphonie peut être évaluée en imageant des cellules exprimant un seul fluorophore.
L’évaluation de l’efficacité de détection d’une molécule donneuse ou acceptrice nécessite une connaissance du rapport entre le nombre de molécules donneuses et acceptrices donnant lieu au signal de mesure. Le nombre de fluorophores exprimés dans les cellules vivantes varie d’une cellule à l’autre et est inconnu. La sonde d’étalonnage utilisée dans cette méthode, une protéine de fusion donneur-accepteur un-à-un, permet de déterminer l’efficacité relative de détection des molécules donneuses et acceptrices.
Pour commencer, utilisez un vecteur d’expression cellulaire de mammifère N1 avec mCherry 1 pour générer la sonde de fusion EGFP mCherry 1. Concevoir des oligonucléotides pour amplifier l’EGFP sans codon stop en tant que fragment BAM h1 de la cellule. Le liant à cinq acides aminés entre la protéine fluorescente verte et rouge devrait donner un déficit moyen en FRET pour la paire donneur-accepteur de cerises GFP de 0,25 à 0,3.
Utilisez n’importe quelle lignée cellulaire et média sans rouge de phénol pour réduire la fluorescence de fond. Une fois que les cellules sont confluentes à 80%, détachez-les avec un millilitre d’EDTA à 0,05% de trypsine et ensemencez environ 10 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de huit puits en ajoutant trois gouttes d’une suspension cellulaire de cinq millilitres. 24 heures après le placage, transfecter les cellules à l’aide d’un milieu de transfection approprié.
Incuber les cellules pendant 20 heures avant l’imagerie des cellules vivantes pour permettre l’expression, le repliement et la maturation appropriés des protéines fluorescentes. Imagez les cellules dans une chambre environnementale humidifiée et chauffée à 37 degrés Celsius avec un microscope à balayage confocale. Pour tamponner le milieu cellulaire au pH physiologique, ajoutez 20 HEPES millimolaires pour rendre le milieu cellulaire indépendant du dioxyde de carbone.
Montez ensuite la lame sur le microscope. Utilisez la raie de 488 nanomètres du laser argon ionique pour exciter le GFP et le laser à diode 561 nanomètres pour exciter la cerise. Configurez le laser de 488 nanomètres pour l’excitation dans le canal un à travers une bande d’émission de 505 à 530 nanomètres et dans le canal deux avec un filtre passe-long de plus de 585 nanomètres.
Utilisez le laser 561 nanomètres pour l’excitation dans le canal trois avec un filtre passe-long de plus de 585 nanomètres. Excitez les deux lasers séquentiellement et réglez le mode d’imagerie pour qu’il bascule après chaque ligne afin que l’excitation de l’image de 512 x 512 pixels alterne après chaque ligne. Configurez une mini-série chronologique de trois images pour détecter si un photoblanchiment important se produit et réduire la puissance laser si nécessaire.
Tout d’abord, les cellules d’image exprimant la construction de fusion de cerises GFP. Définissez les paramètres qui définissent l’intensité laser intégrée dans le temps par pixel dans une image confocale. Utilisez un objectif d’huile 63X et un zoom réglé sur 3X pour imager une cellule dans son intégralité avec un grossissement et une résolution suffisants.
Visez une taille de pixel de 70 à 80 nanomètres. Réglez le temps de séjour des pixels sur deux à quatre microsecondes et la transmission AOTF pour le laser 488 nanomètres et 561 nanomètres de sorte que les images montrent un bon rapport signal sur bruit sans blanchissement et sans pixels indiquant une saturation de l’intensité de fluorescence. Ajustez la puissance laser de 488 et 561 de sorte que les niveaux de signal dans les canaux un et trois soient similaires.
Réglez le gain du multiplicateur photo sur 600 à 800. Image 15 à 20 cellules exprimant la protéine de fusion GFP cerise, cellules exprimant GFP, cerise, GFP et cerise, et cellules non transectées. Puis les cellules d’image co-exprimant les protéines d’intérêt couplées à la GFP et à la cerise respectivement.
Pour calculer FRET, mesurez le signal du donneur dans le canal un, le canal donneur avec une excitation de 488 nanomètres et une bande d’émission de 505 à 530 nanomètres. Ensuite, mesurez le signal accepteur dans le canal trois, le canal accepteur avec une excitation et une émission de 561 nanomètres au-dessus de 585 nanomètres. Enfin, mesurez le signal FRET dans le canal deux, le canal de transfert avec une excitation et une émission de 488 nanomètres au-dessus de 585 nanomètres.
Le signal dans le canal deux est une somme de quatre composantes différentes: le débordement spectral du signal donneur éteint dans le canal de détection plus de 585 avec un facteur de diaphonie S1, le signal accepteur de l’excitation directe par une lumière de 488 nanomètres avec un facteur de diaphonie S2, l’émission sensibilisée de l’accepteur par FRET à partir de la molécule donneuse excitée, et le signal de fond. Les images ont été obtenues dans le canal donneur, le canal de transfert et le canal accepteur, les cellules exprimant uniquement la GFP, la cerise seulement, la GFP co-exprimant et la cerise, et la protéine de fusion de la cerise GFP sont montrées. Les efficacités cellulaires moyennes de FRET calculées dans les cellules NRK exprimant la protéine de fusion GFP de la cerise et celles co-exprimant la GFP sont tracées en fonction du rapport accepteur-donneur d’intensité ou du rapport moléculaire dans chaque cellule.
Des images FRET pixel par pixel normalisées de cellules exprimant la protéine de fusion de la cerise GFP, co-exprimant la GFP et la cerise en tant que contrôle négatif et exprimant les sous-unités du récepteur Ashwell-Morell sont montrées ici. Les RHL1 et 2 de la lectine hépatique du rat ont été marquées avec de la GFP et de la cerise du côté cytoplasmique de la membrane plasmique. Les efficacités cellulaires moyennes FRET des cellules exprimant la GFP RHL1 et la cerise RHL2 et le stock delta GFP RHL1 et la RHL2 cerise sont tracées en fonction du rapport moléculaire accepteur-donneur.
L’approche FRET quantitative présentée permet ce qui suit. Détection des interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante. Changements dans les interactions protéiques au fil du temps.
Différences dans les interactions dans les compartiments subcellulaires jusqu’au niveau pixel par pixel d’une image confocale. Et la dépendance du signal FRET détecté sur le rapport accepteur-donneur moléculaire exprimé dans une cellule vivante.
