Nous avons développé une méthodologie de cartographie FRET qui permet l’identification et la caractérisation des sites de liaison des ligands, de l’orientation des sous-unités, des changements conformationnels associés à la liaison aux ligands et des mouvements dynamiques des protéines. Un avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en solution et que les molécules peuvent se déplacer librement. Les distances mesurées par cette technique sont appropriées pour les systèmes biologiques.
FRET est largement applicable à de nombreux systèmes. La cartographie améliore la surveillance des changements structurels et dynamiques dans tout système biomoléculaire et est particulièrement efficace s’il existe des informations structurelles tridimensionnelles. Après avoir purifié la protéine, la partie la plus difficile est l’étiquetage avec une grande efficacité et l’élimination du colorant libre.
Pour les expériences, il est utile d’avoir le moins de colorant libre possible. Pour commencer, choisissez des sites d’étiquetage dans un intervalle de 25 à 75 angström du site de liaison punitive et dans des régions relativement statiques de la protéine. La distance déterminera la paire de colorant FRET spécifique à utiliser.
Localisez les sites de marquage dans des régions protéiques relativement distinctes les unes des autres. Ainsi, les sites décrivent les sommets d’un triangle, avec le site de liaison punitive situé au centre. Pour mesurer les valeurs R0, en fonction de la taille et du volume de la cuvette souhaitée, préparez deux échantillons de protéines à la même concentration de protéines totales.
Un avec la protéine marquée avec le colorant donneur uniquement, et un avec la protéine marquée avec le colorant accepteur uniquement. Allumez le fluoromètre et ouvrez le programme d’acquisition et d’analyse spectrale dans le logiciel FluorEssence, si vous utilisez un spectrofluoromètre. Cliquez sur le M rouge pour connecter l’ordinateur à l’instrument et choisissez Spectres d’émission.
Entrez les paramètres de balayage à l’aide de l’élément de menu Collecter l’expérience, tels que la longueur d’onde d’excitation, la plage de balayage d’émission, la température et le changement de position de l’échantillon. Cliquez sur RTC et optimisez les réglages de l’instrument comme décrit dans le manuscrit, en surveillant l’émission de fluorescence au pic à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation réglée au maximum d’absorption du colorant. Placez l’échantillon de protéine étiqueté par donneur dans le porte-échantillon, puis cliquez sur exécuter pour générer un scan d’émission de la protéine étiquetée avec le colorant donneur uniquement, en excitant l’échantillon au maximum d’absorption du colorant et en balayant le pic d’émission.
Établissez une base de référence pour l’analyse en étendant l’analyse à 25 à 50 nanomètres au-delà de la fin du pic. Mesurer le rendement quantique de la protéine donneuse uniquement en effectuant des absorptions et des mesures de fluorescence sur des échantillons de différentes concentrations, comme décrit dans le manuscrit du texte. Préparez des échantillons de protéines du donneur seulement, de protéines d’accepteur seulement et de protéines de donneur-accepteur, à la même concentration.
Obtenez le scan du donneur uniquement pour générer des spectres d’émission de fluorescence. Excitez la solution au maximum d’absorption du colorant donneur et balayez les pics d’émission du donneur et de l’accepteur. Échangez l’échantillon contre la protéine accepteur uniquement, ou changez l’échantillon changez votre position pour la cuvette contenant la protéine accepteur uniquement.
Obtenez un scan d’émission de la protéine marquée avec le colorant accepteur uniquement. Excitez l’échantillon à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Échangez l’échantillon contre l’échantillon de protéine donneur-accepteur ou changez l’échantillon changez votre position pour la cuvette contenant la protéine marquée donneur-accepteur.
Obtenez un scan d’émission de l’échantillon de protéine donneur-accepteur en utilisant les mêmes paramètres. Pour tous les spectres, corrigez la fluorescence de fond en soustrayant les nombres de fond mesurés à la fin du balayage. Utilisez un programme de visualisation graphique 3D tel que PyMOL pour mapper les distances sur la structure, en entrant directement les commandes du script dans la fenêtre de commande avec les informations de distance appropriées.
Générez un shell pour chaque distance mesurée et l’erreur associée. Cartographiez la position à travers l’intersection des différentes coquilles. Le site de liaison du peptide signal a été cartographié en utilisant trois emplacements différents sur SecA et SecYEG, et quatre emplacements différents sur le peptide signal.
Les expériences FRET entre différentes régions de la pré-protéine et trois emplacements distincts sur les protéines SecA et SecYEG cartographient le site de liaison et l’orientation de la pré-protéine. Le site de liaison punitive du peptide signal a déjà été identifié comme le doigt à deux hélices, et la queue C-terminal SecA suggérait une orientation parallèle au doigt à deux hélices. Des spectres FRET à l’état d’équilibre entre SecA37 et PhoA2 et PhoA22 ont été obtenus.
La réduction de l’intensité du donneur a indiqué qu’une plus grande énergie était transférée de PhoA22. Par rapport au site PhoA2, qui est situé plus loin de SecA37. Les spectres de désintégration de fluorescence résolus dans le temps ont démontré que le complexe donneur-accepteur a une désintégration homogène plus courte compatible avec le transfert d’énergie associé à une distance.
Les coquilles de distance FRET construites entre le résidu SecA PhoA2 et les sites triangulés ont démontré que chaque coquille se croise avec le doigt à deux hélices, le site de liaison supposé, qui est indiqué en vert. La zone entrecoupée est plus petite que chaque coque FRET et comprend une contribution importante de l’échafaudage hélicoïdal. Les coquilles de distance FRET déterminées entre le résidu PhoA2 et les sites marqués décrivent une zone plus petite située plus près de l’extrémité du doigt à deux hélices et de la bouche du canal SecYEG.
Cette zone croisée est située à l’extrémité opposée du doigt à deux hélices de PhoA2. Les éléments importants à prendre en compte comprennent une sélection appropriée des sites d’étiquetage pour trianguler la zone d’intérêt, mesurer les rendements quantiques pour chaque site et éliminer tout le colorant libre. Cette méthode s’aligne sur les informations structurelles obtenues avec des méthodes telles que la RMN ou la cristallographie aux rayons X.
Lorsque les résultats fret sont placés dans un contexte structurel, ils peuvent améliorer les informations existantes.
