Le protocole fournit une procédure simple pour rendre les expériences FRET par émissions sensibilisées plus reproductibles et comparables. Le principal avantage de FRET sont les mesures en temps réel afin que les processus dynamiques puissent être traités. Pour le réglage laser à l’aide d’un photomultiplicateur de transmission, placez la lame de huit puits contenant les protoplastes transfectés sous le microscope.
Après avoir sélectionné un puits vide, choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, diminuez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable. Ensuite, augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% tout en enregistrant le signal correspondant. Pour le réglage laser à l’aide du mode réfléchissant, sélectionnez un puits vide, puis appliquez un filtre de réflexion.
Activez le mode de réflexion et assurez-vous que la gamme de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser. Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, réduisez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable. Ensuite, déplacez l’objectif à la position la plus basse avant de le remonter jusqu’à ce que la réflexion du couvercle soit visible, puis augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% tout en enregistrant le signal correspondant.
Pour l’évaluation des données, tabulez et triez les données par intensité de signal, puis tracez les intensités de signal par rapport à la puissance laser relative et choisissez les intensités laser résultant en une intensité de signal similaire. Pour le réglage des photomultiplicateurs, sélectionnez un puits vide et appliquez un filtre de réflexion, passez en mode de réflexion et assurez-vous que la plage de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser. Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme, réduisez le gain du détecteur à la moitié du maximum et ajustez l’intensité du laser au bruit de fond détectable.
Ensuite, déplacez l’objectif à la position la plus basse avant de le remonter jusqu’à ce que la réflexion du couvercle soit visible, puis augmentez le gain du détecteur par pas de 50 à 100 volts et enregistrez le signal correspondant. Pour l’évaluation des données, tracez l’intensité par rapport au gain du détecteur pour chaque détecteur, puis choisissez les gains individuels du détecteur pour obtenir une sensibilité similaire. Pour l’acquisition d’images, choisissez les filtres ou les miroirs dichroïques appropriés et utilisez le même miroir dichroïque pour tous les canaux afin de permettre le balayage ligne par ligne, puis sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau pour l’imagerie des cellules vivantes et choisissez le balayage 12 ou 16 bits avec une vitesse de balayage modérée.
Ensuite, définissez la plage de détection de préférence 470 à 510 nanomètres pour la détection des donneurs et 530 à 600 nanomètres pour la détection des accepteurs dans le cas de la paire FRET de protéine fluorescente cyan améliorée ou ECFP et de protéine fluorescente jaune améliorée ou EYFP. Après avoir appliqué les réglages du détecteur et du laser comme démontré précédemment, révisez l’intensité du laser en fonction de la table de puissance laser obtenue si nécessaire. Assurez-vous que le rapport signal/bruit couvre toute la plage dynamique des détecteurs.
Après avoir affiné le diamètre du sténopé tout en maintenant les intensités laser et les gains du détecteur constants, effectuez les mesures FRET en prenant des images d’au moins 20 cellules. Pour déterminer les corrections de diaphonie, effectuez des mesures FRET avec des cellules exprimant uniquement le fluorophore donneur et celles exprimant uniquement le fluorophore accepteur. Pour l’étalonnage des mesures, effectuez des mesures FRET avec des cellules exprimant la fusion de l’accepteur donneur.
Pour l’évaluation des données, obtenez des profils linéaires des cellules en vous assurant que chaque profil ne contient pas plus d’une cellule. Enregistrez les profils sous forme de fichiers texte. Ensuite, à l’aide de l’option d’importation de fichier texte dans la section des données, importez les fichiers texte dans une feuille de calcul.
Ensuite, lisez les valeurs maximales en appliquant la fonction max, puis énumérez les valeurs obtenues dans un tableau comportant chacune une colonne pour l’ID d’émission du donneur, l’émission FRET IF, l’accepteur d’émission IA et au moins quatre ensembles de données, donneur uniquement, accepteur uniquement, fusion donneur-accepteur et mesure. Le réglage laser a révélé une augmentation linéaire de l’émission avec une augmentation de l’intensité laser. Comme le montre une pente plus raide, l’émission de la ligne de 514 nanomètres était beaucoup plus élevée que l’émission de la ligne de 458 nanomètres.
La variation des gains du détecteur à puissance laser constante a révélé un comportement exponentiel pour les deux détecteurs analysés. L’écart et le saignement spectral du donneur et de l’accepteur analysés avec des protéines purifiées recombinantes et analysés avec des cellules exprimant ces protéines démontrent qu’il est impossible d’omettre la détermination du saignement spectral dans les cellules vivantes probablement causées par des pigments cellulaires. L’efficacité FRET entre les sous-unités ATPA vacuolaires marquées, VHA AECFP et VHA AEYFP a diminué avec l’augmentation de l’intensité du signal.
En revanche, l’interaction entre VHA E1 ECFP et VHA CEYFP était indépendante de l’intensité du signal. Le choix des composants optiques appropriés est crucial pour la détection du donneur et de l’accepteur. Ce protocole peut également être appliqué aux capteurs ratiométriques dans les cellules vivantes afin d’augmenter la reproductibilité dans ces expériences.
