Ici, nous décrivons une méthode pédagogique basée sur une inactivation thermique rapide de la protéase pour préserver les peptides intracellulaires naturels, éviter la dégradation dans les cellules et les tissus, suivie d’une quantification relative des peptides à l’aide d’un marquage isotopique. Cette méthode d’étiquetage présente de nombreux avantages. Les réactifs sont disponibles dans le commerce, peu coûteux, chimiquement stables et permettent d’analyser jusqu’à cinq échantillons dans un seul sérum.
Commencez par cultiver des cellules de neuroblastome humain dans un plat de 15 centimètres dans du DMEM contenant 15% fbS et 1% de streptomycine de pénicilline. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez 10 millilitres de PBS, grattez les cellules et collectez-les dans un tube de 15 millilitres.
Centrifugez les cellules à 800 fois G pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Remettre la pastille dans un millilitre d’eau désionisée ultra purifiée à 80 degrés Celsius, puis transférer le contenu du tube dans un tube de microfuge de deux millilitres. Après l’inactivation par la chaleur du poisson-zèbre, recueillir tout le cerveau dans un tube de microfuge de deux millilitres et le congeler à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse.
Resuspendez l’échantillon de tissu dans un millilitre d’eau désionisée ultra purifiée à 80 degrés Celsius et soniquez avec une sonde en utilisant 30 impulsions d’une seconde. Incuber le lysat cellulaire ou homogénérer le tissu à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis le refroidir sur de la glace pendant 10 à 30 minutes. Ajouter 10 microlitres d’une solution mère d’acide chlorhydrique molaire pour chaque millilitre de volume d’échantillon.
Mélanger en vortexant pendant 20 secondes et incuber sur de la glace pendant 15 minutes. Centrifuger le lysat cellulaire ou le tissu homogénéate à 12 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Recueillir le surnageant dans des tubes de microcentrifugation protéique à faible liaison et le stocker à moins 80 degrés Celsius.
Nettoyez les dispositifs d’ultrafiltration avec de l’eau et centrifugez à 2 300 fois G pendant trois minutes, puis jetez l’eau du dispositif d’ultrafiltration. Pipeter le surnageant dans un filtre de coupure prélavé de 10 kilodaltons et tourner dans une centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius. Vérifiez le pH de l’échantillon.
Équilibrez la colonne avec un millilitre de 100% d’acétonitrile, puis lavez-la avec un millilitre de 5% d’acétonitrile avec 0,1% d’acide trifluoroacétique. Chargez le volume complet de l’échantillon dans la colonne et lavez la colonne avec un millilitre d’acétonitrile à 5 % avec de l’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Éluez les peptides de la colonne avec 1,8 millilitre de 1% d’acétonitrile avec 0,15% d’acide trifluoroacétique dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique.
Sécher l’échantillon entièrement dans une centrifugeuse à vide à 30 degrés Celsius et surveiller le temps de concentration affiché. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Remettre en suspension les échantillons peptidiques dans 100 à 200 microlitres d’eau ultra purifiée et pipeter 2,5 microlitres des concentrations peptidiques standard et des échantillons sur la plaque blanche de 96 puits.
Ajouter 25 microlitres de tampon phosphate molaire 0,2 et 12,5 microlitres de fluorescamine. Homogénéiser doucement pendant une minute sur le rotateur orbital. Ensuite, ajoutez 110 microlitres d’eau pour arrêter la réaction.
Réglez les réglages du spectrofluoromètre, puis lisez la plaque. Ajouter 1/10e de volume d’un bromure molaire de triméthylammonium à chaque échantillon peptidique avec jusqu’à 25 microgrammes du peptide. Assurez-vous que le pH est compris entre cinq et huit, en ajustant avec de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium, si nécessaire.
Ajouter quatre microlitres de formaldéhyde non deutéré, de deutéré ou de formaldéhyde deutéré au carbone 13. Mélanger pendant cinq secondes en vortexant. Ajouter quatre microlitres de cyanoborohydrure de sodium ou de cyanoborohydrure de sodium deutéré à l’échantillon peptidique.
Mélangez ensuite l’échantillon pendant cinq secondes en vortexant. Incuber l’échantillon peptidique dans une hotte pendant deux heures à température ambiante, en tourbillonnant toutes les 30 minutes. Répétez l’ajout de formaldéhyde non deutéré, deutéré ou de carbon-13 depérisé et de cyanoborohydrure de sodium ou de cyanoborohydrure de sodium deutéré, en vortexant après chaque addition.
Incuber les échantillons dans la hotte pendant la nuit à température ambiante. Ajouter 16 microlitres de bicarbonate d’ammonium et mélanger par vortex. Placez l’échantillon sur de la glace.
Ajouter huit microlitres d’acide formique à 5% et vortex pendant cinq secondes supplémentaires. Combinez les échantillons de peptides, ajustez le pH entre deux et quatre, puis dessalez les échantillons combinés sur des colonnes de nettoyage en phase inversée à l’aide d’acétonitrile et d’acide trifluoroacétique comme décrit précédemment. Séchez l’échantillon entièrement dans une centrifugeuse à vide à 30 degrés Celsius, puis stockez-le à moins 20 degrés Celsius.
Les peptides marqués sont observés à l’aide de spectres de masse. Les flèches rouges indiquent la présence de paires de pics de différents peptides marqués avec deux formes isotopiques, L1 et L5, pour la comparaison entre deux échantillons différents S1 et S2 respectivement. Le spectre massique d’un peptide présent dans trois échantillons différents, S1, S2 et S3, marqués respectivement avec des étiquettes L1, L3 et L5 est montré ici.
Un étiquetage quadruplex a été effectué. Les échantillons témoins S1 et S3 ont été marqués avec L1 et L3 respectivement et comparés à deux échantillons expérimentaux, S2 et S4 marqués avec L2 et L4.No différence significative a été observée. Le marquage isotopique a été utilisé pour montrer les substrats dans les produits in vitro pour une protéase ou une peptidase donnée.
Un peptide qui ne change pas en présence de l’enzyme neurolysine est montré ici. Les peptides qui disparaissent ou diminuent en présence de l’enzyme sont des substrats, tandis que ceux qui augmentent sont considérés comme des produits. La figure est un exemple d’identification d’une séquence peptidique effectuée par un moteur de recherche de base de données étiqueté avec trois formes différentes de balises.
Avant qu’il ne soit défini, assurez-vous que l’échantillon est complètement frais pour éviter de briser les liaisons peptidiques causées par l’acidification dure. De plus, le nettoyage des dispositifs d’ultrafiltration est essentiel. La spectrométrie de masse est une excellente méthode pour quantifier les peptides entre différentes conditions expérimentales et pour les études d’analyse en identifiant les substrats de peptidase.
