Les auteurs remercient Céline Jeanty pour son aide dans la création de granulés cellulaires avec traitement du MG-132 tel que décrit dans les résultats représentatifs et Elise Mommaerts pour sa fourniture de granulés E. coli utilisés dans le protocole.

1. Préparation d’une norme de peptide lourd
<ol><li>Selon le fournisseur et la qualité des peptides lourds achetés, les peptides lourds devront être dilués. Ce protocole utilisait les séquences peptidiques rapportées dans le tableau 1,l’acide aminé c-terminal ayant été modifié en Lysine(13C615N2-lysine) ou arginine(13C615N4-arginine).<ol>
<li>Mélanger les peptides lourds, diluer le mélange avec 50% d’acétylonitrile (ACN) pour créer un mélange de peptide avec chaque peptide à 10 μM.</li>
		<li>Créer des aliquots du mélange peptidique et les conserver à -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Exemple de lyse REMARQUE : La stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en compte lors de la préparation de l’échantillon. Gardez les échantillons biologiques et les tampons refroidis à 4 °C et ajoutez des échantillons au tampon de stabilisation de l’ubiquitine aussi rapidement que possible.<ol>
<li>Préparer une solution de 1 M NH4HCO3 (bicarbonate d’ammonium) dans l’eau et ajuster le pH à 8 à l’aide de 1 M NaOH.</li>
		<li>Préparer une solution de 200 mM N-éthylmaleimide (NEM) dans l’eau.</li>
		<li>Préparer le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à l’aide de 8 M d’urée dans 50 mM NH4HCO3/10mM NEM. Le tampon de stabilisation ubiquitine doit être préparé fraîchement à chaque fois. REMARQUE : Une solution de 5 mL de 8 M d’urée nécessitera beaucoup moins de 5 mL d’eau étant donné l’expansion de l’eau lorsqu’elle est dans une solution saturée d’urée. ATTENTION: Ne préparez pas le tampon au-dessus de 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Resuspendez l’échantillon biologique à étudier dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine visant 0,5 μg/μL de protéines et lyse les cellules avec une méthode appropriée pour l’échantillon. Une méthode de sonication composée de trois impulsions de 10 s avec un sonificateur SFX 150 Branson réglé à 70% d’intensité avec 10 ruptures de glace entre chaque impulsion, a été utilisée pour les lignées cellulaires dans ce protocole.</li>
		<li>Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.</li>
		<li>Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à faible teneur en protéines. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade si nécessaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l’échantillon et des contrôles
	<ol>
<li>Si les échantillons sont congelés, mélanger (p. ex., à l’aide d’un thermomixeur) pendant qu’ils sont décongelés pour dissoudre rapidement l’urée. ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.</li>
		<li>Transférer 20 μg d’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse fraîchement à faible liaison et ajuster le volume à 50 μL avec tampon de stabilisation de l’ubiquitine.</li>
		<li>Créez un contrôle négatif à l’aide d’un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Dans cet échantillon, aucune version légère de chaque peptide ne devrait être présente, permettant l’observation de toute contamination légère résultant des peptides lourds spike-in. Ce contrôle négatif a également été utilisé pour la planification du temps de rétention du PRM décrite à l’article 3.1.</li>
		<li>Un contrôle positif a également été créé avec le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et l’ajout de types de chaîne disponibles dans le commerce au volume normalisé du tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Généralement, K63, K48, et M1 sont disponibles. Dans les résultats représentatifs 20 ng de K48, K63, et M1 ont été utilisés.</li>
	</ol></li>
	<li>Réduction, alkylation et digestion
	<ol>
<li>Préparer une solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (NH4HCO3)dans l’eau et ajuster l’échantillon au pH = 8 avec 1 M NaOH.</li>
		<li>Une culture d’E. coli cultivée dans le bouillon LB a été centrifugée 5 000 x g pendant 5 min pour former une pastille, qui a ensuite été lavée 2x avec PBS avant la résuspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à 5 μg/μL.</li>
		<li>Ajouter 1 μg de lysate E. coli à chaque échantillon et contrôler. Ce protocole utilise E. coli (DH10B), mais tout lysate complexe sans ubiquitine peut être utilisé. Notez que l’ubiquitine est commune à tous les eucaryotes. REMARQUE : L’utilisation d’une matrice de lysate E. coli réduit la perte de peptides due à l’adhérence non spécifique aux plastiques. Ceci est particulièrement visible dans le contrôle négatif ou des échantillons avec une teneur limitée en protéines et a un fort impact sur l’observation de K6312.</li>
		<li>Préparer une solution de tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) de 500 mM dans l’eau de qualité SP (la TNT peut être utilisée comme alternative).</li>
		<li>Réduire les échantillons et les contrôles par l’ajout du PTCE à une concentration finale de 50 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 30 min à température ambiante (RT). Si la TNT est utilisée, la température doit être élevée à 50 °C. ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.</li>
		<li>Préparer une solution de chlorocétamide de 550 mM (CAA) en NH4HCO3. Stockez dans le noir.</li>
		<li>Alkylate les échantillons et les contrôles en ajoutant CAA à une concentration finale de 55 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 20 min à RT dans l’obscurité. REMARQUE : Caa est employé au lieu de l’iodoacetamide comme agent de réduction pour diminuer le risque d’une modification double de carbamidomethyl (114.0429) sur un résidu de lysine étant confondu avec une modification de -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Ajouter l’endopeptidase LysC aux échantillons à un rapport de 1:25 (w/w) à la teneur en protéines. Incuber pendant 3 h à 37 °C.</li>
		<li>Diluer les échantillons et les contrôles avec 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Ajouter la trypsine aux échantillons à un rapport de 1:25 w/w à la teneur en protéines. Incuber pendant 12 h à 37 °C.</li>
		<li>Ajouter une solution d’acide formique (FA) de 10 % dans l’eau de qualité SP à un rapport v/v de 1:10 à chaque échantillon et contrôler l’échantillon. Vérifiez que le pH est <3) avant le nettoyage C18 et ajouter plus d’acide formique si nécessaire.</li>
		<li>À chaque échantillon et contrôle ajouter 0,5 μL de la norme peptidique lourde créée dans la section 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Nettoyage peptidique
	<ol>
<li>Plusieurs fabricants offrent des conseils ou des assiettes de nettoyage C18. Suivez les instructions du fabricant pour le produit utilisé, et séchez les peptides élités dans une centrifugeuse sous vide, prête pour l’analyse de la SP.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse par LC-MS/MS
<ol><li>Exécutez l’analyse prm initiale sur la norme peptidique lourde d’une manière imprévue.<ol>
<li>Resuspendez les échantillons séchés dans 10 μL de tampon de chargement de SP 2 % d’acide trifluoroacétique ACN/0,05 % d’acide trifluoroacétique (AFE).</li>
		<li>Équipez un HPLC d’une colonne analytique de phase inverse C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 perles Å C18) conçue pour les gradients linéaires de nanoflow MS. Formez des gradients linéaires échangeant de l’eau de qualité MS complétée par 0,1 % de FA avec acn contenant 0,1 % de FA. Une colonne de piège sacrificielle (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 perles Å C18) pour préserver la durée de vie de la colonne analytique a été utilisée ici, mais n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Couplez la sortie de la colonne analytique à une source nano-ESI sur un spectromètre de masse haute résolution.</li>
		<li>Utilisez une méthode protéomique ciblée appropriée pour le spectromètre de masse. Par exemple, sur un Q-Exactive plus une méthode de deux expériences, cycle entre une SEp complète et une expérience PRM. Pour l’expérience full MS, une résolution de 120 000 avec un objectif AGC de 1e6 et 240 ms comme IT maximum a été utilisée. Pour l’expérience PRM, la même cible AGC et le maximum de TI ont été utilisés avec une résolution inférieure de 60 000 et une fenêtre d’isolement de 1,2 m/z.</li>
		<li>Injectez 200 ng de contrôle négatif sur la colonne analytique à l’aide de l’autosampler HPLC. Appliquer un gradient linéaire à l’échantillon sur la colonne analytique, augmentant la concentration d’ACN de 2 à 25 % sur une période d’environ 45 min. REMARQUE : La concentration d’ACN de 25 % est plus faible que d’habitude pour la protéomique en raison de la faible nature hydrophilique des peptides typiques caractéristiques de la topologie de l’ubiquitine. Si d’autres peptides doivent être quantifiés, une concentration plus élevée d’ACN peut être souhaitée pour atteindre une bonne séparation de cible.</li>
		<li>Analyser les résultats de l’exécutement de planification tel que décrit à la section 4.2 pour créer une liste d’inclusion planifiée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des échantillons<ol>
<li>Exécutez les échantillons restants tels que décrits pour la planification en 3.1 en dehors de l’utilisation de la liste d’inclusion planifiée créée à la section 4.2. REMARQUE : Un blanc doit être exécuté après le contrôle positif pour s’assurer qu’aucun report de l’exécuter précédent n’est détecté dans les échantillons ultérieurs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse logicielle
<ol><li>Créez une liste d’inclusion de mise en forme appropriée pour la SP utilisée. Ce protocole a utilisé le logiciel open source Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), qui offre un soutien et une aide bien documentés. Une liste d’inclusion peut être créée pour plusieurs spectromètres de masse à l’aide de l’installation de liste d’isolement des exportations.<ol>
<li>Ouvrez un nouveau document Skyline.</li>
		<li>Choisissez des modifications isotopiques lourdes, le cas échéant, aux peptides lourds caractéristiques de la topologie. Dans paramètres| Paramètres peptidique sous l’onglet Modification, cliquez sur le champ nom pour voir la modification potentielle. La sélection est basée sur l’état isotopique des peptides lourds achetés. Dans cet exemple, des peptides synthétiques transportant soit une lysine lourde(13C615N2-lysine) soit une arginine lourde(13C615N4-arginine) au C-terminus ont été utilisés. Les étiquettes appropriées seraient : « Étiquette : 13C(6)15N(2) (C-term K) » et « Label:13C(6)15N(4) (C-term R) ».</li>
		<li>Sélectionnez Paramètres| Transition. Sous l’onglet Filtre comprennent Les charges précurseurs 2, 3, 4.</li>
		<li>Insérez des peptides en sélectionnant Edit| Insérez| Peptides.</li>
		<li>Remplissez les champs pertinents, y compris la séquence peptidique caractéristique de la topologie et un nom protéique (p. ex., « Chaîne-K63 »).</li>
		<li>Élargissez chaque peptide maintenant indiqué dans le panneau Cibles. Supprimez les états de charge non désirés. L’état de charge préféré et l’énergie de collision, qui peuvent différer en fonction du spectromètre de masse utilisé, pour chaque peptide caractéristique de la topologie sont indiqués dans le tableau 1.</li>
		<li>Pour chaque peptide caractéristique de la topologie (à l’exception de M1 où le GG est inclus dans la séquence) cliquez à droite sur la séquence et sélectionnez Modifier. Ajouter un GG comme une modification structurelle en cliquant sur le champ de nom et la sélection <Afficher tousles ... > avant de sélectionner "GlyGly (K)« .</li>
		<li>Exporter la liste d’isolement Fichier| L’exportation| Liste d’isolement, sélectionnez le type d’instrument, et définissez le type de méthode à la norme. Sélection OK ouvrira une invite pour enregistrer un fichier *.csv qui peut être utilisé pour créer une méthode PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Créez une liste d’inclusion planifiée basée sur un lourd processus de planification peptidique expliqué ici à l’aide du logiciel Open source Skyline.<ol>
<li>Créez une liste de cibles telle que décrite à la section 4.1.</li>
		<li>Importez l’exécutement de planification en 3.1 en sélectionnant le fichier| L’importation| Résultats.</li>
		<li>Examinez les pièces d’identité. Le signal lourd pour chaque peptide est observable en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd. La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais le logiciel peut nécessiter une curation manuelle en sélectionnant le pic en utilisant le clic et la traînée sous l’axe x.</li>
		<li>Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour le PRM. La fenêtre de planification peut être modifiée sous Paramètres| Paramètres Peptide à l’aide de l’onglet Prédiction, en changeant la fenêtre de temps.</li>
		<li>Une liste d’inclusion planifiée peut maintenant être exportée à l’aide de File| L’exportation| Liste d’isolement et sélection du type d’instrument approprié et le type de méthode de réglage à scheduled.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser les données.<ol>
<li>Importez les échantillons de la même manière que pour l’analyse de l’exécutement de planification à la section 4.2.</li>
		<li>Après l’importation complète de tous les échantillons, la curation des transitions est recommandée. Il s’agit du processus par lequel les transitions avec des interférences ou de faibles rapports signal-bruit sont supprimées. Un exemple de chromatogramme avant et après la curation est indiqué dans la figure 4.</li>
		<li>Les données peuvent maintenant être exportées soit en cliquant à droite sur les graphiques pertinents et en sélectionnant les données copy, soit en sélectionnant le fichier| L’exportation| Résultats.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

L’analyse de l’état d’ubiquitine dans un protéome est d’une importance croissante pour une grande variété de questions biologiques. La description de l’état d’ubiquitination d’un échantillon doit se concentrer non seulement sur le profil des protéines étant ubiquitinées, mais aussi sur la topologie d’une telle ubiquitination. L’évaluation de cette topologie par SP ciblée, telle que décrite ici, a un rôle à jouer dans un large éventail d’études biologiques.
I...

La régulation étroite de la fonction et de la stabilité des protéines est d’une importance primordiale, car ils sont les principaux moteurs du contrôle phénotypique de la biologie. La fonction d’une protéine est construite à partir de deux composants : sa séquence intrinsèque de polypeptide et toutes les modifications posttranslationnelles (MPT). Divers M PTM chimiques ont été identifiés, y compris la glycosylation, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation1. En 1975, Goldstein et coll.2 ont identifié une petite protéine et l’ont nommée ubiquitine en raison de sa nature omniprésente. L’ubiquitine s’est trouvée importante dans la dégradation deprotéine 3. Cependant, depuis lors, il a été établi que la fonction de l’ubiquitine en tant que molécule de signalisation s’étend bien au-delà de la régulation de la stabilité des protéines. La signalisation d’ubiquitine est impliquée dans un large éventail d’autres fonctions biologiques, telles que la stabilisation de protéine, l’autophagie, le contrôle de cycle cellulaire, et le trafic deprotéine 4.
Alors que d’autres MNP sont généralement binaires (c.-à-d. que la protéine est modifiée ou non modifiée) pour un site donné, l’ubiquitine peut modifier une protéine à la fois comme monomère ou comme chaîne polymérique, l’ubiquitine ci-jointe étant elle-même ubiquitinée. En outre, cette chaîne de polyubiquitination peut se développer dans plusieurs topologies avec l’ubiquitination de l’ubiquitine précédente s’attachant à l’un des huit sites deliaison 5,6. L’ubiquitine est transférée par un processus enzymatique en plusieurs étapes (figure 1) où le C-terminus d’ubiquitine est relié à l’un de ses sept résidus de lysine (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou au terminal N de l’ubiquitine précédente (appelée ubiquitination M1 ou linéaire)5,6. Cette topologie de chaîne est la clé du sort de la protéine en cours de modification. Par exemple, la modification avec une chaîne liée au K48 ou au K11 entraîne la dégradation de la protéine modifiée au protéasome, tandis qu’une chaîne linéaire est nécessaire pour l’activation de la signalisation NF-kB. Ainsi, la répartition relative de ces topologies de chaîne est pertinente à une grande variété de questions biologiques.
L’utilisation de la spectrométrie de masse (SP) est particulièrement bénéfique pour l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine car elle ne dépend pas d’interactions basées sur les anticorps ou les affinités7,8, dont beaucoup ont une spécificité limitée et ne font pas de distinction entre les différents types de chaînes. Une autre possibilité de détection est d’utiliser des mutants ubiquitine génétiquement modifiés. Ici, une lysine spécifique est échangée contre de l’arginine, qui ne peut pas soutenir la modification par l’ubiquitine. L’absence de formation de chaîne d’ubiquitine sur la protéine de substrat est alors interprétée comme évidence pour une topologie spécifique9.
L’identification basée sur la SP des protéines ubiquitinées est basée sur le fait que le C-terminus d’ubiquitine contient un résidu d’arginine dans la position 74 qui est reconnu par la trypsine pendant la préparation protéolytique des échantillons pour l’analyse de la SP, séparant la double glycine du terminal C. Ce GlyGly (-GG) reste attaché au groupe ε-aminé du résidu de lysine de la protéine de substrat. Pour l’analyse de topologie d’ubiquitine, la modification se produit sur l’un des sept résidus de lysine de l’ubiquitine. Cela crée un ensemble de sept peptides clés qui transportent un résidu de lysine qui est modifié par GG, spécifique pour chacune des topologies (Figure 2). Par exemple, avec la topologie K06, la lysine à la position 6 sur la séquence des acides aminés sera protégée de la digestion tryptique avec une modification de -GG de 114 Da ajoutée à cette lysine.
L’identification de peptides prédéterminés spécifiques par la SP est appelée protéomique ciblée, ou plus précisément acquisition ciblée de peptides10. Deux méthodes ont été développées en fonction des performances du spectromètre de masse utilisé. Il s’agit d’une surveillance des réactions sélectionnée (GRS), également appelée surveillance des réactions multiples (MRM) et de la surveillance parallèle des réactions (PRM). SRM implique la sélection des transitions composées du précurseur m/z et de l’ion produit m/z. Inversement, PRM ne nécessite que le précurseur m/z. Après sélection, une analyse complète des ions du produit est effectuée. Cela a l’avantage qu’aucune sélection d’ions de produit appropriés pour la quantitation sur le spectromètre de masse spécifique n’est nécessaire avant lamesure 11. SRM et PRM peuvent, selon l’instrument, être programmés. La planification est la pratique consistant à attribuer une fenêtre de temps au cours de laquelle un ion particulier sera inclus pour analyse, car les peptides s’échappent à des moments de rétention définis à partir du système chromatographique. La réduction du nombre d’ions interrogés à un moment donné augmente la fréquence des interrogatoires des ions prévus à ce moment-là, améliorant ainsi l’exactitude des données.
En général, l’application de la protéomique ciblée pour la topologie de l’ubiquitine est la même que toute autre expérience protéomique ciblée. Cependant, deux différences clés sont importantes : premièrement, la stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en considération. Il existe de multiples enzymes déubiquitines puissantes (DUB) qui dégradent rapidement les chaînes lors de la lyse cellulaire. Les protéases spécifiques à l’ubiquitine se équipent en deux catégories, les thioesterases et les métalloproteases. La plupart des ubiquitine-hydrolases sont des thioesterases et portent un résidu de cystéine dans leur centre actif. En alkylating ce résidu de cystéine, ils peuvent être inactivés. En tant que tel, l’utilisation de tampons de stabilisation de l’ubiquitine contenant des agents alcalinateurs, comme l’éthylmaleimide N (NEM), et des produits chimiques très dénaturants, et de garder les échantillons réfrigérés est essentielle à une analyse réussie. Deuxièmement, contrairement à d’autres expériences ciblées, le choix du peptide est fixé. Dans une expérience ciblée typique, un peptide protéotypique peut être sélectionné pour une bonne performance chromatographique et ionisation. Pour certains peptides caractéristiques de la topologie tels que K48, ces propriétés sont bonnes, tandis que pour d’autres, elles sont moins souhaitables. Par exemple, la chromatographie K33 dans une configuration typique en phase inverse est pauvre en raison de la formation d’un profil d’élitution étiré, et les faibles propriétés d’ionisation du peptide K27 réduisent sa visibilité par MS12.
Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer l’évaluation de topologie d’ubiquitine d’un échantillon biologique par PRM. Des données d’exemple pour la procédure sont présentées utilisant une perturbation du protéasome utilisant le traitement inhibiteur de MG-132 dans plusieurs types différents de cellules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

L’évaluation du profil global des topologies de chaîne d’ubiquitine dans un protéome est d’intérêt pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Le protocole décrit ici tire parti de la modification de la di-glycine (-GG) laissée après la digestion tryptique de l’ubiquitine incorporée dans une chaîne. En quantifiant ces peptides caractéristiques de la topologie, l’abondance relative de chaque topologie de la chaîne d’ubiquitine peut être déterminée. Les étapes nécessaires pour quantifier ces peptides par une expérience parallèle de surveillance des réactions sont signalées en tenant compte de la stabilisation des chaînes d’ubiquitine. La préparation des contrôles lourds, la lyse cellulaire, et la digestion sont décrites avec la configuration appropriée de spectromètre de masse et le flux de travail d’analyse de données. Un exemple de données avec des perturbations dans la topologie de l’ubiquitine est présenté, accompagné d’exemples de la façon dont l’optimisation du protocole peut affecter les résultats. En suivant les étapes décrites, un utilisateur sera en mesure d’effectuer une évaluation globale du paysage de topologie ubiquitine dans leur contexte biologique.

Pour démontrer l’utilisation d’une analyse de chaîne d’ubiquitine par PRM, trois lignes cellulaires ont été choisies : une ligne de cellule de mélanome de souris B16, et les deux lignes communes de cellules humaines A549 (cellules épithéliales alvéolaires alvéolaires adénocaronomiques) et HeLa (cellules cancéreuses cervicales). Ces cultures sont passée à la phase médiane dans les médias appropriés avant d’être traitées avec 0, 10 ou 100 mM MG-132 pendant 4 h avant la récolte. MG-132 est un inhi...

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Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.4K vues.  Luxembourg Institute of Health. Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Recherche

Biochimie

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

Observation en temps réel de la réaction d’échange de brin ADN médiée par Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Électrophorèse hybride Clear/Blue native pour la séparation et l’analyse des supercomplexes de la chaîne respiratoire mitochondriale

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Caractérisation fonctionnelle des ligases d'ubiquitine RING-Type E3 In Vitro et In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.

Isolement et analyse des lipoprotéines plasmatiques par ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.