Cette méthode fournit de nouvelles informations sur la façon de produire en masse des conidies infectieuses de champignons entomopathogènes pour lutter contre les insectes nuisibles importants dans les agro-écosystèmes commerciaux, compte tenu de la situation actuelle où la plupart des insecticides sont progressivement éliminés en raison de préoccupations concernant leur effet toxique sur l’environnement et la santé humaine. La technique décrit la méthode utilisée pour assurer le rendement optimal des conidies EPF lors de la production de masse. La méthode est utile pour la lutte intégrée contre les ravageurs et la lutte biologique en fournissant un aperçu de l’efficacité des conidies produites en masse pour la gestion à grande échelle des insectes nuisibles résistants aux insecticides nuisibles dans les agro-écosystèmes.
Cette procédure a été développée et démontrée par le Dr Letodi Luki Mathulwe, le Dr Nomakholwa Faith Stokwe et le professeur Antoinette Paula Malan. Chauffez un litre d’eau distillée et éteignez le feu avant d’atteindre le point d’ébullition. Maintenant, ajoutez 30 grammes de glucose, quatre grammes de phosphate de potassium dibasique, 20 grammes d’extrait de levure, 15 millilitres de liqueur de maïs et portez le contenu à ébullition douce pendant deux à trois minutes.
Versez un total de 100 millilitres du milieu dans neuf flacons différents de 250 millilitres. Placez un bouchon de coton sur chaque flacon et recouvrez le coton avec du papier d’aluminium comme bouchon. Autoclavez le milieu dans les flacons pendant 55 minutes à 121 degrés Celsius.
Plus tard, laissez refroidir le milieu dans les flacons et ajoutez 10 milligrammes par millilitre de streptomycine au milieu dans chaque flacon. Recueillir deux à trois boucles bactériennes de conidies fongiques dans des plaques de culture fongiques vieilles de deux à trois semaines pour les deux isolats de FPE. Transférer les conidies fongiques dans chaque 100 millilitres de milieu liquide dans les flacons de 250 millilitres dans des conditions stériles et sceller les flacons.
Incuber les flacons de culture liquide à environ 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital à 140 tr / min pendant trois jours et cesser l’incubation une fois que les cultures montrent des signes de turbidité élevée avec la croissance fongique des blastospores. Pour détecter toute contamination bactérienne possible des cultures, prélever un échantillon de 100 microlitres dans chaque flacon de culture liquide après 24 heures d’incubation et plaquer sur trois plaques SDA par isolat. Incuber les plaques pendant 48 heures à une température contrôlée de plus ou moins 25 degrés Celsius.
Utilisez un petit tuyau de déchets de polychlorure de vinyle pour créer un goulot pour le sac de fermentation à l’extrémité ouverte du sac d’autoclave et utilisez du ruban adhésif pour fixer le tuyau. Fermez le tuyau avec un bouchon de coton stérile pour permettre un échange de gaz suffisant pendant la fermentation. Utilisez du riz blanc à grains longs étuvé comme substrat solide pour les blastospores de Metarhizium pinghaense et de Metarhizium robertsii.
Pour chaque sac de fermentation, ajoutez un kilogramme de riz et 300 millilitres d’eau distillée stérile. Mélangez délicatement le contenu des sachets de fermentation. Placez-les dans des sacs d’autoclave extérieurs en position verticale et autoclavez à 121 degrés Celsius pendant 55 minutes.
Après l’autoclavage, laissez les substrats refroidir pendant environ 45 minutes dans des conditions stériles. Retirer la fermeture de chacune des fioles de culture liquide de Metarhizium pinghaense et de Metarhizium robertsii sous un écoulement laminaire et enflammer le bord de chaque fiole pendant 10 secondes. Versez 100 millilitres de cultures liquides dans les sacs de fermentation en retirant les bouchons de coton de leur cou.
Replacez les bouchons de coton et couvrez le haut du cou du sac avec du papier chirurgical fixé avec un élastique. Tournez la partie supérieure du sac et mélangez le contenu du sac en secouant et en manipulant le substrat par massage. Incuber les sacs à environ 25 degrés Celsius en aplatissant le substrat dans les sacs pour éviter la formation de lits épais.
Deux à trois jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible et la liaison du substrat par le champignon se sont produites, briser le substrat dans les sacs de fermentation en massant le contenu des sacs. Après la fermentation, transférer les cultures sporulées dans des sacs en papier brun de 26 à 30 kilogrammes et sécher les cultures fongiques pendant 10 à 12 jours avant leur utilisation dans les essais. Pour améliorer la résistance à la traction des sacs en papier, coupez horizontalement 1/3 de la partie supérieure du sac et tapissez le fond du sac.
Émietter doucement le substrat dans chaque sac de fermentation. Coupez le coin de chaque sac et transférez lentement toute la culture dans les sacs en papier à travers l’espace laissé par le coin coupé. Étiquetez chaque sac en papier, pliez-le deux fois sur l’extrémité supérieure de chaque sac et fermez-le avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire.
Placez les sacs sur des séchoirs en fil de fer pour permettre un séchage correct et uniforme à une température contrôlée d’environ 25 degrés Celsius et une faible humidité de 30 à 40% Récoltez les conidies fongiques des cultures à l’aide de trois tamis imbriqués montés sur une casserole de collecte. Chargez lentement l’échantillon de culture sèche sur le maillage ETS numéro 35 et le tamis. Placez un couvercle sur le tamis pour éviter la libération de conidies fongiques dans l’air.
Ajouter 10 à 12 billes de verre aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis à mailles et éviter la rétention des conidies dans le tamis, ce qui peut réduire la récupération des spores. Scotchez et scellez les joints du tamis à l’aide de ruban adhésif électrique. Placez les tamis sur un agitateur vibrant équipé d’un tampon collant pour fixer le bac de collecte et les tamis pendant 20 à 25 minutes à un mouvement de 560 à 640 vibrations par minute.
Retirez les tamis d’essai de la casserole de collecte, collectez les conidies et rangez les conidies collectées dans des sacs à fermeture à glissière étanches à l’air et imperméables à l’eau pour un stockage à long terme. Une moyenne d’environ 1,83 gramme de conidies sèches de Metarhizium robertsii a été récoltée sur le substrat d’orge en flocons, tandis qu’aucun Metarhizium pinghaense n’a été récolté sur le substrat. Aucune conidie fongique sèche n’a été récoltée sur le substrat d’avoine en flocons pour les deux espèces de Metarhizium.
Une différence significative a été observée entre les deux espèces de Metarhizium dans les conidies moyennes estimées par gramme récolté à partir des grains de riz. Metarhizium robertsii avait un nombre moyen de conidies par gramme légèrement plus élevé que Metarhizium pinghaense. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux espèces de Metarhizium dans le nombre estimé de conidies présentes sur le substrat de riz usé.
Cependant, Metarhizium pinghaense avait des conidies légèrement plus élevées sur le substrat de riz que Metarhizium robertsii Aucune différence significative n’est estimée chez les deux espèces de Metarhizium dans leur rendement global en conidies obtenues à partir des cultures de substrat de riz. Cependant, Metarhizium pinghaense a produit un rendement de conidies légèrement plus élevé que Metarhizium robertsii, qui a produit un rendement de conidiale inférieur. La partie difficile de cette technique est la contamination du substrat par inoculation avec un inoculum de blastospores contaminé.
Ainsi, assurez-vous toujours de la stérilité tout en travaillant. Cette démonstration aide les élèves à reproduire efficacement la technique sans erreurs maladroites pouvant entraîner la fin de l’ensemble du processus.
