Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

Il existe plusieurs méthodes pour mesurer la production de ROS, ou stress oxydatif dans les cellules. Parmi ceux-ci, la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine de 2'7'est l’une des techniques les plus largement utilisées pour mesurer directement l’état redox. Cette sonde est lipophile et non fluorescente. La diffusion de cette sonde à travers la membrane cellulaire permet aux estérases intracellulaires de cliver les deux liaisons ester, produisant un produit relativement polaire et imperméable à la membrane cellulaire. Ces molécules non fluorescentes s’accumulent intracellulairement, et l’oxydation subséquente par ROS donne le produit hautement fluorescent dichlorofluorescéine. L’oxydation de la sonde est le produit de l’action de plusieurs types de ROS. Qui peut être détecté par cytométrie en flux ou microscopie confocale. Dans cet article, nous avons utilisé une sonde de diacétate de dichlorofluorescéine pour mesurer et quantifier les ROS par cytométrie en flux. Transférer les plaques de 6 puits dans une hotte à flux laminaire à partir de l’incubateur. Aspirer le surnageant. Et lavez les cellules une fois avec PBS. Ajouter 2 mL de DMEM faible sérique par puits. Et incuber la plaque de 6 puits pendant deux heures dans l’incubateur. Traitez les cellules avec l’antioxydant pendant six heures. Traiter les cellules avec l’inducteur ROS, A ou B, pendant 30 minutes. Aspirer le surnageant. Et lavez la cellule trois fois avec PBS pour éliminer tous les stimuli. Éteignez la lumière de la hotte à flux laminaire et travaillez dans l’obscurité. Ajouter 1 mL de sonde de diacétate de dichlorofluorescéine dans le DMEM sans rouge de phénol. Ajouter 1 mL de DMEM sans rouge phénol aux cellules témoins de contrôle de l’autofluorescence. Incuber la plaque à 6 puits pendant 30 minutes dans l’incubateur. Transférer les plaques sur la glace au laboratoire. Lavez les cellules trois fois avec 2 mL de PBS froid par puits. Ajouter 0,5 mL de tampon de détachement à froid à chaque puits. Récoltez les cellules en piquant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000. Collectez-les dans un tube étiqueté de 1,5 mL. Et centrifugez-les à 600 x g pendant cinq minutes à 4 C.Jetez soigneusement le surnageant et dissociez doucement la pastille avec le taraudage. Ajouter 1 mL de tampon FACS pour laver les cellules de chaque tube étiqueté. Si nécessaire, utilisez le vortex dans la plus faible intensité pour la dissociation complète de la pastille. Centrifugez-les à 600 x g pendant cinq minutes à 4 C.Répétez cette étape deux fois plus. Trois lavages au total. Remettre en suspension des pastilles de cellules dans 200 L de tampon FACS. Dissocier complètement la pastille dans chaque tube en utilisant le vortex. Et transfert à 5 mL étiquetés pour les tubes de cytomètre en flux. Gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient analysés sur cytomètre en flux. À l’aide du logiciel de cytométrie en flux, créez une nouvelle expérience. Cliquez sur l’échantillon et ouvrira une liste de tubes. Double-cliquez dessus et renommez-les. Placez le tube de contrôle de l’autofluorescence sur le bras de l’aspirateur, en déplaçant soigneusement la base uniquement vers la gauche. Cliquez sur Acquérir des données, puis sur Enregistrer les données, puis sélectionnez la condition d’arrêt souhaitée. Dessinez une porte autour des cellules d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris. Retirez le tube. Cliquez sur Tube suivant et exécutez l’exemple de contrôle basal. Cliquez sur Acquérir des données, puis sur Enregistrer les données.Ouvrez le logiciel. Ajoutez les exemples à l’aide du bouton d’action Ajouter des exemples. Cliquez sur Ajouter un échantillon.Sélectionnez le dossier Date expérimentale et cliquez sur Choisir.Double-cliquez sur le premier exemple de votre espace de travail, contrôle d’autofluorescence dans ce cas. Dessinez une porte polygonale pour isoler la cellule d’intérêt, en excluant les cellules mortes et les débris. Remplacez le tracé par un histogramme. Double-cliquez dans le M