Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Cette méthode peut être utilisée pour analyser les espèces réactives cellulaires d’oxygène dans les cellules adhérentes avec seulement un microscope de fluorescence, et quantifier l’intensité réactive d’espèces d’oxygène avec le lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable. Commencez par ensemencement deux fois 10 à la cinquième HCT116 cellules cancéreuses colorectales dans DMEM dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.

Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le milieu de culture par 100 sulfate ferreux micromolaire, ou 10 micromolaires contenant de la doxorubicine, et incubez la plaque pendant encore 24 heures. Préparez la solution DCFH-DA en dissolvant 4,85 milligrammes de DCFH-DA en un millilitre de DMSO pour faire une solution de stock de 10 millimolaires.

Juste avant de l’ajouter aux puits, diluer le stock avec du DMEM préchauffé pour faire une solution de travail de 10 micromolaires, et le vortex pendant 10 secondes. Pour tacher les cellules, retirez le milieu contenant de la drogue et lavez-les une fois avec du DMEM. Ajouter 500 microlitres de solution de travail DCFH-DA dans chaque puits, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, retirer le DCFH-DA des puits et les laver deux fois avec du DMEM, et une fois avec du PBS. Ajouter ensuite 500 microlitres de PBS à chaque puits. Utilisez le canal de protéines fluorescentes vertes sur le microscope à fluorescence pour prendre des images représentatives des cellules.

Retirez ensuite le PBS et ajoutez 200 microlitres de tampon d’analyse de radioimmunoprécipation à chaque puits. Incuber la plaque sur la glace pendant cinq minutes et recueillir les lysates de la cellule en tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger les tubes à 21, 130 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Transférer ensuite 100 microlitres du supernatant dans une plaque noire de 96 puits. Utilisez un lecteur de microplaque à une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres, et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres, pour mesurer la fluorescence dans chaque puits. Ensuite, mesurez la concentration de protéines avec l’essai de Bradford en transférant un microlitre du supernatant à une plaque claire de 96 puits avec 100 microlitres de solution d’analyse protéique.

Utilisez les concentrations de protéines pour normaliser les intensités de fluorescence. HCT116 cellules cancéreuses côlorectales ont été traitées avec 100 sulfate ferreux micromolaire, ou 10 doxorubicine micromolaire, pour induire l’effort oxydant. Comme prévu, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par les deux traitements.

Pour quantifier les changements relatifs d’intensité, les cellules ont été lysées et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité relative de fluorescence a été sensiblement augmentée par le sulfate ferreux ou la doxorubicine. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de rendre la solution DCFH-DA fraîche et d’éviter l’exposition à la lumière, ainsi que de minimiser les perturbations de l’état cellulaire, et d’effectuer un lavage PBS étendu juste avant de prendre l’image.

En plus de la détection du ROS total par ce protocole, spécifiquement ROS comme le peroxyde peut être effectuée.