Notre méthodologie simple et pratique peut être utilisée pour obtenir l’ADSCS abondant pour étudier l’adipogenèse de PVAT in vitro et pour tester les drogues normales contre l’obésité et les maladies cardio-vasculaires connexes. L’avantage de cette méthode est la fluorescence inhérente des NCADSCs de biotine dont vous avez besoin pour étiqueter les cellules avec des anticorps conjugués flou-chrome pour FACS, ou le tri magnétique des cellules activées. Cette méthode peut être utilisée pour acquérir l’ADSC abondant dérivé des cellules neurales de crête de l’ectoderm pour étudier l’adipogenèse de PVAT, ou lipogenèse in vitro.
L’utilisation de jeunes souris et l’expérience de la cautérisation et de l’adipogenèse induite signifient que les cellules 3T3 sont essentielles au succès de ce protocole. La démonstration de la procédure sera Yiding Qi, un étudiant diplômé, et Lian Xu, un technicien de mon laboratoire. Pour la dissection paat, après stérilisation de la carcasse de souris dans 75% d’éthanol pendant cinq minutes, utilisez des ciseaux pour couper et séparer la peau sur l’abdomen.
Couper le long de la ligne médiane ventrale du bassin au cou, et ouvrir l’abdomen. Déplacez le foie pour exposer le diaphragme, et coupez le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane. Peler les côtes pour exposer le cœur et les poumons.
Et enlever les poumons et le thymus. Extraire le PAAT avec l’aorte et le cœur dans une boîte de Pétri. Et couper l’aorte à la racine aortique pour enlever le cœur.
Ensuite, faites une coupe entre l’arc aortique et l’aorte descendante. Séparez soigneusement le tissu adipeux entourant les deux structures, et les artères carotides communes gauche et droite de la paroi thoracique postérieure. Il est important de séparer le PAAT de la racine et comme un plus grand vaisseaux vasculaires soigneusement, est la présence de cellules murales vasculaires peuvent affecter l’efficacité facs.
Placez le tissu dans une boîte de Pétri contenant de la glace froide HBSS tampon. Et utilisez des forceps stériles pour enlever autant de vasculature et de fascia que possible. Ensuite, transférez le tissu adipeux dans un tube Eppendorf de deux millilitres, contenant le point cinq millilitres de tampon HBSS glacé sur la glace.
Lorsque tout le PAAT a été recueilli, transférer le tissu adipeux récolté dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres contenant un millilitre de milieu de digestion fraîchement préparé. Et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour émincer les tissus. Transférer le lisier tissulaire dans un tube de 50 millimètres contenant neuf millilitres de milieu de digestion frais.
Et utilisez une pipette d’un millilitre pour triturer les tissus 10 fois. Lorsqu’une solution homogène a été obtenue, incuber le tube pendant 30 à 45 minutes à 37 degrés Celsius et 100 révolutions par minute, en vérifiant toutes les cinq à dix minutes pour prévenir la surdigestion. Quand une solution homogène légère de tissu d’adipeux peut être observée sur le tourbillonnement doux du tube, arrêtez la digestion avec cinq millilitres de HDMEM complétés avec le sérum bovin foetal de 10%.
Après un mélange complet, centrifuger l’échantillon de tissu adipeux. La fraction des cellules vasculaires stromales sera visible sous forme de granulés brunâtres. Suspendre à nouveau la pastille en 10 millilitres de milieu de culture et filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire à cellules de 70 micromètres.
Recueillir les cellules par une autre centrifugation. Et re-suspendre doucement la pastille en cinq millilitres de tampon de lyse érythrocytes. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres.
Après 10 minutes, arrêtez la réaction avec deux centrifugations dans 10 millilitres de PBS, complétées par le sérum bovin foetal de 1%. Après la deuxième centrifugation, suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de milieu de culture sur la glace. Et recueillir les cellules avec une centrifugation finale.
Puis, re-suspendre les cellules en cinq millilitres de tampon FACS pour le comptage. Pour mettre en place une culture NCADSC, après leur isolement par FACS selon les protocoles standard, placez les cellules à cinq fois 10 à la troisième cellule par centimètre concentration carrée dans chaque puits, une plaque de culture douze puits. Milieu de culture incomplet à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone pendant 20 à 24 heures.
Le lendemain, laver les cellules avec 37 degrés Celsius PBS, et nourrir la culture avec un milieu de culture frais. Lorsque la culture atteint 80 à 90% confluency, traiter les cellules avec deux millilitres de 0,25%trypsine EDTA par puits pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont été détachées du fond de la plaque, neutraliser les enzymes avec deux millilitres de milieu cultivé, et recueillir les cellules récoltées par centrifugation.
Suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de milieu de culture frais pour le comptage. Et ensemencer les cellules dans une nouvelle plaque de culture de puits 12 dans une concentration de cinq fois 10 à la troisième cellules par centimètres de concentration au carré. Puis, re-suspendre les cellules restantes dans le milieu de culture complétée par 10% de sulfure de diméthyle pour le stockage congelé dans l’azote liquide.
Pour induire une différenciation adipogène, lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, traitez les cellules avec un milieu d’induction adipogène brun ou blanc pendant deux jours, le cas échéant. À la fin de l’incubation, lavez doucement les cellules deux fois avec du PBS avant d’ajouter le milieu d’induction adipogène frais approprié à chaque puits, et de retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour trois à cinq jours supplémentaires d’incubation. Les CNCADSC cultivés atteignent une confluence de 80 à 90 % après sept à huit jours de culture.
Et démontrer une fibre de verre élargie comme la morphologie. Pour confirmer davantage leur potentiel adipogenic, la coloration rouge d’huile des NCADSCs différenciés peut être exécutée pour détecter des adipocytes mûrs. Typiquement, des adipocytes mûrs sont observés après huit jours d’induction adipogène blanche ou brune avec plus de 60% des NCADSCs présentant la différenciation adipogène.
Notez que les NCADSC démontrent un potentiel adpogenic considérablement réduit après passage. L’immunoblotting et le PCR quantitatif en temps réel révèlent que l’expression des protéines et des gènes relatifs spécifiques aux adipocytes augmente considérablement dans les NCADSCs adipogènement différenciés après huit jours d’induction adpogenic blanche. De même, l’expression de gènes spécifiques aux adipocytes et de gènes spécifiques aux adipocytes bruns augmente également significativement après huit jours d’induction adipogène brune.
Étant donné que la plupart des protocoles d’isolement de la NCADSC sont simples, économiques et ne nécessitent pas l’utilisation d’anticorps, pour cela, les fortes raisons liquides de l’intensité de l’IFP peuvent améliorer l’efficacité de l’alimentation facs.
