Les protéines photoréceptrices marquées GFP, comme le canal ionique TRPL GFP, nous permettent d’étudier le transport des protéines dans les neurones en utilisant des techniques non invasives. Cette méthode peut également être utilisée pour surveiller la dégénérescence des photorécepteurs. Ainsi, la base moléculaire des maladies héréditaires entraînant la cécité chez l’homme peut être étudiée dans l’œil de la drosophile.
La localisation cellulaire des protéines marquées GFP peut être évaluée en observant la fluorescence dans le pseudopagoule profond ou par microscopie à immersion dans l’eau. Les deux méthodes permettent de déterminer rapidement la localisation des protéines visuelles et d’observer les défauts structurels des rhabdomeres dus à la dégénérescence des cellules photoréceptrices. Pour obtenir des images de haute qualité, l’aspect le plus important est l’orientation de l’œil de mouche.
Lors de l’exécution de cette technique, il faut se concentrer sur les ommatidies situées légèrement vers la périphérie de l’œil. Je ferai la démonstration de la procédure d’imagerie DPP, tandis que les deux techniques utilisant la microscopie à immersion dans l’eau seront démontrées par ma collègue, la Dre Krystina Wagner, et Matthias Zeger, un étudiant au doctorat de notre groupe. Pour commencer l’imagerie de pseudopupile profond, ou DPP, anesthésiez des mouches âgées d’un à trois jours et positionnez l’une d’entre elles au centre de l’objectif du microscope sur le côté afin que l’œil gauche ou droit soit orienté vers l’objectif avec précision radialement.
Augmentez le grossissement pour l’adapter à l’ensemble de l’œil et centrez les ommatidies centrales de l’œil. Si possible, diminuez la profondeur de champ du microscope en ajustant le diaphragme à double iris à un réglage peu profond. Ensuite, allumez la lampe UV du microscope à l’intensité maximale.
Ensuite, sélectionnez l’ensemble de filtres de fluorescence du microscope en fonction de la protéine de fluorescence exprimée dans les yeux et définissez le chemin de la lumière vers la caméra montée au microscope. À l’aide de la fonction d’imagerie en direct du logiciel, ajustez la luminosité de l’image à un réglage qui détecte uniquement les signaux spécifiques de l’œil en augmentant le temps d’exposition et en gagnant de la valeur. Réajustez la mise au point du microscope dans l’œil pour générer l’image superposée du DPP.
Ensuite, prenez un instantané du DPP fluorescent. Pour préparer une mouche dans une variante létale, collez un morceau de pâte à modeler sur une glissière d’objet et une autre pièce au centre d’une boîte de Pétri. Remplissez la boîte de Pétri avec de l’eau distillée glacée et des flocons de glace.
Ensuite, placez une mouche anesthésiée par la glace sous un stéréomicroscope au-dessus de la lame d’objet recouverte de plasticine. Tournez la mouche sur le dos et percez une épingle à insectes au centre du thorax. Fixez la broche horizontalement sur la glissière d’objet recouverte de pâte à modeler et orientez l’œil gauche ou droit de la mouche vers le haut.
Ensuite, fixez soigneusement la glissière de l’objet avec son côté sans pâte à modeler tourné vers le bas dans la boîte de Pétri, empêchant ainsi la rotation de la tête de mouche. Assurez-vous que l’œil de la mouche est recouvert d’eau. Alternativement, pour préparer une mouche dans une variation non létale, transférez la mouche anesthésiée par la glace la tête la première dans une pointe de pipette de 200 microlitres et poussez soigneusement la mouche vers la pointe avec de l’air comprimé.
Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez la pointe de la pipette juste devant la tête et, à l’aide d’une pince à épiler, poussez soigneusement la mouche de quelques millimètres dans la pointe de la pipette. Coupez à nouveau l’extrémité de la pipette et repoussez la mouche vers la pointe avec l’air comprimé de sorte que seule la tête de la mouche dépasse de la pointe de la pipette. Après avoir collé un morceau de pâte à modeler sur une glissière d’objet, appuyez sur la pointe de la pipette de manière à ce que l’œil gauche ou droit soit tourné vers le haut.
Assurez-vous que l’œil est correctement orienté au microscope. Pour l’acquisition d’images, sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau. Dans le cas d’une variation non létale, utilisez une pipette de laboratoire pour faire adhérer une grande goutte d’eau glacée sur la face inférieure de l’objectif d’immersion dans l’eau.
Placez soigneusement la lame de l’objet avec la mouche préparée sur la scène du microscope. Ensuite, abaissez manuellement l’objectif d’immersion dans l’eau jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la surface de l’eau ou que l’œil de la mouche touche la goutte. Ensuite, basculez le chemin de la lumière vers la caméra du microscope et générez une image en direct.
Réajustez la mise au point de l’appareil photo et évaluez l’orientation de l’œil, en considérant que l’œil doit faire face radialement à l’objectif du microscope. Utilisez le logiciel de table de choix pour détecter la sursaturation. Dans le cas des mouches non pigmentées, ajustez le temps d’exposition de manière à ce que les pixels les plus brillants soient juste en dessous de la limite de saturation pour chaque image.
Enregistrez une image et enregistrez-la en tant que fichier brut pour archiver toutes les métadonnées correspondantes de l’enregistrement. Ensuite, exportez l’image dans un format tif. Pour quantifier la fluorescence eGFP relative dans les rhabdomeres des micrographies à immersion dans l’eau, ajustez les paramètres ImageJ en cliquant sur Analyser, puis sur Définir les mesures, et cochez uniquement la case Valeur grise moyenne.
Importez l’image tif en cliquant sur Fichier, puis sur Ouvrir. Choisissez une région représentative de l’image mise au point et agrandissez-la de 200 à 300 % en appuyant plusieurs fois sur Ctrl et ensemble. Ensuite, sélectionnez l’outil Ovale et, tout en appuyant sur la touche Maj, générez une sélection circulaire dans l’image qui est nettement plus petite qu’un rhabdomere fluorescent.
Ensuite, recherchez la taille exacte affichée sous la barre d’outils dans la fenêtre principale d’ImageJ. Pour mesurer les intensités de fluorescence dans la sélection circulaire, déplacez le cercle vers le premier rhabdomere avec les touches fléchées du clavier, puis cliquez sur Analyser, puis sur Mesurer. Une fenêtre de résultats répertoriant la valeur grise mesurée apparaîtra.
Continuez avec des mesures de rhabdomeres deux à six, et mesurez également le signal de fond. Dans le cas des mouches non pigmentées, effectuez des mesures supplémentaires des zones du corps cellulaire correspondantes. Mesurez la fluorescence de deux autres ommatidies, ce qui donne trois répliques techniques.
Marquez les ommatidies analysées à l’aide de l’outil Crayon et enregistrez cette image pour la documentation. Sélectionnez et copiez les valeurs de gris mesurées dans la fenêtre de résultats, puis collez-les dans un tableur pour d’autres calculs. Triez les valeurs d’intensité de fluorescence en fonction de leur origine dans les catégories rhabdomere, corps cellulaire et arrière-plan, et calculez l’intensité moyenne de chaque catégorie.
Ensuite, calculez la quantité relative d’eGFP présente dans le rhabdomere en utilisant la première formule pour les yeux non pigmentés et la seconde pour les yeux pigmentés. Alternativement, pour quantifier la morphologie des yeux par fluorescence eGFP dans des micrographies à immersion dans l’eau, choisissez trois ommatidies adjacentes dans une région représentative de l’image qui est mise au point. Évaluez individuellement les 18 rhabdomeres de la sélection en fonction de leur intensité eGFP, de leur netteté des bords et de leur contraste par rapport au signal de fond environnant.
Enfin, notez les rhabdomeres clairement visibles avec une valeur de deux, les rhabdomeres visibles hebdomadaires avec une valeur de un, et les rhabdomeres absents avec une valeur de zéro pour générer un indice de dégénérescence. Chez les mouches transgéniques de la drosophile exprimant une protéine de fusion eGFP TRPL, la fluorescence rhabdomerale disparaît à la lumière en raison de la translocation de l’eGFP TRPL. Cela permet d’effectuer un criblage génétique pour identifier les mutants défectueux dans l’internalisation de l’eGFP TRPL.
Chez les mouches témoins, eGFP TRPL se transloque hors des rhabdomeres dans le corps cellulaire après 16 heures d’éclairage, ce qui entraîne une diminution significative de la fluorescence rhabdomerale par rapport à l’état adapté à l’obscurité. La deuxième incubation sombre élève à nouveau la fluorescence rhabdomerale vers la valeur initiale. Cependant, dans la translocation TRPL défectueuse mutant vps35MH20, le schéma de fluorescence ne change pas radicalement après 16 heures d’éclairage et une adaptation ultérieure à l’obscurité pendant 24 heures.
Cette méthode de quantification permet de détecter un défaut de recyclage statistiquement très significatif. Les mouches aux yeux blancs permettent la détection de signaux de fluorescence provenant à la fois du rhabdomere et du corps cellulaire. En revanche, chez les mouches aux yeux rouges, les signaux de fluorescence ne sont détectables que dans les rhabdomeres mais pas dans le corps cellulaire.
En ce qui concerne la quantification de la dégénérescence rétinienne, la fluorescence eGFP TRP peut être évaluée sur plusieurs semaines. Lorsqu’il est maintenu dans un cycle d’obscurité de 12 heures et de 12 heures pendant deux semaines, l’indice de dégénérescence diminue chez les mouches mutantes, mais pas chez les mouches témoins. Dans ce protocole, il faut faire la différence entre les yeux pigmentés et non pigmentés.
Étant donné que la pigmentation affecte le signal fluorescent, la microscopie quantitative à immersion dans l’eau a été optimisée pour les deux cas individuellement. L’imagerie DPP et la microscopie à immersion dans l’eau sont des méthodes à haut débit avec une résolution limitée. Pour étudier la localisation subcellulaire, nous recommandons la microscopie par immunofluorescence sur les coupes de tissus.
Pour une analyse détaillée des phénotypes dégénératifs, une microscopie électronique peut être effectuée.
