Nous avons développé un test et un flux de travail de diagnostic COVID 19 à faible coût, basés sur la salive, faciles à mettre en œuvre et à mettre à l’échelle pour les applications de dépistage communautaire à grande échelle. Ici, nous utilisons des robots de manipulation de liquides open source, des thermocycleurs standard et des logiciels pour effectuer des tests directs de salive sans tampons d’extraction ou de stabilisation tout en fournissant des résultats de diagnostic précis. Grâce aux flux de travail parallèles automatisés simples, le système peut être mis à l’échelle pour effectuer des milliers de tests par jour avec un minimum d’équipement, d’espace et de personnel.
En plus de Kylie King, Rachel Ham, notre superviseure de laboratoire clinique et Austin Smothers, notre coordonnatrice de l’éducation, aideront à démontrer la procédure Commencez par décontaminer l’extérieur des tubes de collecte de salive avec 70% d’éthanol et les transférer au laboratoire pour analyse. Enregistrez l’arrivée de l’échantillon en scannant chaque code-barres d’échantillon dans la feuille de calcul de l’apport quotidien. Traiter thermiquement les échantillons de balayage pendant 30 minutes dans un four à 95 degrés Celsius, puis retirer les échantillons à l’aide de gants résistants à la chaleur.
Ouvrez les feuilles de calcul de chargement d’échantillons quotidiens pour chaque robot de chargement d’échantillons à la station d’affectation d’échantillons. Attribuez ensuite 188 échantillons à chaque plaque de 384 puits. Bacs d’étiquettes avec le nom de la plaque, la date et le numéro de trimestre.
Analysez les échantillons dans l’ordre dans la feuille de calcul de chargement des exemples. À la station de chargement des échantillons, alignez deux ensembles complets de huit racks imprimés en 3D, correspondant à l’emplacement du pont dans le robot. Décapsulez les tubes quart un et placez-les dans des racks imprimés en 3D, en commençant par la position A1 dans le premier rack.
Remplissez chaque rack de gauche à droite et de haut en bas. Continuez ce modèle de chargement dans le rack deux, puis passez aux racks quatre et cinq. Placez les porte-échantillons chargés quart un sur les ponts un, deux, quatre, cinq, sept, huit, 10, 11.
Placez les embouts P20 sur les ponts trois et neuf. Pour simplifier le processus de configuration, chargez les matériaux de l’arrière vers l’avant dans le robot. Les plaques de mélange principales sont produites sur un robot dédié et stockées à quatre degrés Celsius.
Une plaque est utilisée à la fois et est étiquetée avec le nom de la plaque, et une lame tranchante est utilisée pour couper une ligne dans la feuille autour des puits de contrôle. Placez la plaque de mélange principale sur le pont six et décollez le couvercle en aluminium, en laissant derrière lui le petit rectangle recouvrant les puits de contrôle. Découvrez les boîtes à embouts et fermez le robot.
Initialisez le protocole d’exploitation Python personnalisé en cliquant sur Démarrer exécuter via l’application de bureau du robot. Chaque trimestre prend 24,5 minutes à charger sur la plaque. Réglez une minuterie comme rappel.
Pendant que le robot fonctionne, décapez et chargez deux tubes d’échantillonnage dans le deuxième ensemble de racks imprimés en 3D. Lorsque le robot s’interrompt, retirez les racks quart un et remplacez-les par les racks quart deux, puis cliquez sur Reprendre l’exécution dans l’application de bureau. Récapitulez les tubes d’échantillon du premier trimestre et conservez-les dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius en attendant les résultats.
Répétez ce processus de chargement pendant les troisième et quatrième trimestres. Transférez la plaque chargée dans une armoire de biosécurité. Pour minimiser la contamination, gardez la plaque couverte pendant le transfert.
Rassemblez tous les échantillons répétés et attribuez-les comme derniers échantillons au quatrième trimestre. Numérotez les échantillons, scannez les codes-barres et entrez l’emplacement de l’échantillon d’origine et le résultat dans la feuille de calcul de chargement de l’échantillon. Transférez les échantillons répétés dans l’armoire de biosécurité.
Ne chargez pas les tubes d’échantillonnage répétés dans les racks de chargement du robot. Pipette deux microlitres de chaque échantillon répété vers les puits corrects. Utilisez la pipette désignée pour ajouter des échantillons de patients.
Gardez les puits de contrôle recouverts de papier d’aluminium tout en ajoutant des échantillons pour minimiser la contamination. Enlevez la couverture de papier d’aluminium sur les puits de contrôle à l’aide de pinces. Pipeter deux microlitres d’échantillons de patients positifs confirmés dans les puits M23 et M24.
Pipette deux microlitres d’eau sans nucléase aux puits N23 à N24 et deux microlitres de 200 copies par microlitre mélangé témoin positif aux puits O23 à O24. Laissez les puits P23 à P24 vides pour surveiller la qualité des lots du mélange maître. Couvrez la plaque avec un joint optiquement transparent et utilisez le rouleau applicateur pour adhérer à tous les puits.
Vortex la plaque à 2 500 tr / min pendant 30 secondes pour bien mélanger, puis centrifuger la plaque à 500 fois G pendant une minute. Sélectionnez le programme de protocole dans le logiciel de thermocycleur et enregistrez le protocole pour les futures plaques. Placez la plaque scellée dans le thermocycleur et exécutez le protocole.
Exportez les valeurs CT et copiez-les dans l’exemple de feuille de calcul de chargement. Pour le contrôle positif, vérifiez si au moins un puits témoin positif produit des valeurs CT comprises entre 22 et 28 pour les sondes P1 et N1. Alternativement, les puits d’échantillon positifs connus produisent des valeurs CT P1 et N1 inférieures à 33 sur les sondes P1 et N1.
Pour le contrôle négatif, vérifiez qu’il n’y a pas de valeurs CT N1 ou P1 dans l’un ou l’autre des deux puits témoins négatifs. Vérifiez que les valeurs CT ont des courbes d’amplification valides avant d’invalider la plaque. Si P1 produit un résultat de CT inférieur à 33, considérez le puits comme valide et procédez au résultat de N1. Si P1 produit un résultat de CT supérieur ou égal à 33 ou aucune valeur CT, considérez le puits comme non valide.
Si N1 produit un résultat de tomodensitométrie inférieur à 33, évaluez le puits comme oui. Si N1 ne produit pas de valeur CT, évaluez le puits comme non. Si N1 produit une valeur CT supérieure ou égale à 33, évaluez le puits comme aucune étoile.
Vérifiez que toutes les valeurs N1 CT sont associées à une courbe d’amplification réelle. Si une valeur CT pour N1 n’a pas de courbe d’amplification, le puits est no. Identifiez les échantillons répétés, étiquetez-les avec un numéro d’échantillon interne et un type d’échantillon et retournez-les au flux de travail de chargement.
Les images représentatives montrent la détection par PCR RTQ de l’ARN synthétique N1 ou SARS CoV-2 et de l’ADN synthétique P1 ou HSRPP30. Les courbes standard ont été tracées avec des écarts-types pour déterminer la plage de détection précise à l’aide de cette combinaison d’amorce de sonde. Les valeurs moyennes de CT obtenues dans les dilutions respectives ont été tracées par rapport à la quantité estimée d’ARN synthétique et d’ADN synthétique.
Dans les deux cas, les courbes linéaires ont montré de bons coefficients de corrélation sur un large éventail de concentrations de copies de gènes. Les valeurs de tomodensitométrie N1 obtenues à partir d’échantillons uniques à l’aide du robot et du chargement manuel de l’échantillon ont été transposées pour déterminer la variabilité entre le chargement manuel et le chargement du robot. La relation linéaire entre les méthodes manuelles et automatisées a produit un coefficient de corrélation élevé indiquant que les deux méthodes sont fonctionnellement équivalentes.
La variabilité intra-essai a également été déterminée à l’aide des valeurs CT N1 réplicatives transposées obtenues à partir du robot et du chargement manuel de l’échantillon. L’évaluation des méthodes de traitement thermique pour la réduction de la viscosité dans la salive est présentée ici. La salive négative du SRAS CoV-2 a été recueillie à partir d’une seule source et les aliquotes ont été traitées thermiquement pendant zéro minute, 30 minutes ou 60 minutes à 95 degrés Celsius.
Les valeurs de tomodensitométrie P1 à partir de répétitions techniques de chaque condition ont été tracées pour déterminer la variabilité entre les méthodes de traitement. Les méthodes de traitement thermique de 30 minutes et de 60 minutes ont produit une diminution significative de la variabilité de l’échantillon par rapport à l’absence de contrôle du traitement. Il n’y avait pas de différence significative entre les traitements de 30 minutes et de 60 minutes.
Par conséquent, la méthode de traitement thermique de 30 minutes a été mise en œuvre pour réduire le temps de traitement. Utilisez une technique aseptique appropriée pour minimiser la contamination des plaques d’essai, en particulier lors du chargement manuel des échantillons et des commandes. Évitez de croiser l’assiette avec vos mains ou vos manches.
Une fois les résultats cliniques produits, les échantillons peuvent être éliminés dans des déchets à risque biologique ou ils peuvent être conservés pour une analyse plus approfondie, comme le séquençage du génome entier pour déterminer des souches spécifiques. Cette technique permet des tests communautaires à grande échelle, ce qui nous permet d’étudier les effets de la couverture des tests et de la propagation non symptomatique du Covid 19.
