Notre protocole étudie la diversité des levures et des moisissures dans le sol à l’aide d’échantillons de sol provenant de différentes régions climatiques. Cela fournit des informations sur la diversité des levures environnementales et aide à suivre les espèces pathogènes. Le protocole offre une méthode rentable et rapide de récolte des levures et des moisissures du sol.
Les échantillons de sol peuvent être entièrement traités pour obtenir des isolats en aussi peu que sept jours. Une configuration expérimentale bien organisée, telle que l’étiquetage des tubes de culture et la préparation des milieux un jour à l’avance, est la clé pour éviter de se sentir dépassé pendant l’expérience. Commencez par préparer un ensemble de tubes de culture stériles de 13 millilitres.
En les étiquetant avec l’ID de l’échantillon de sol, utilisez ensuite une pipette sérologique pour ajouter cinq millilitres de bouillon d’extrait de levure-peptone-dextrose complété par du chloramphénicol et du bénomyl dans chaque tube. À l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, transférer environ 0,1 gramme de sol dans le tube de culture approprié à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de plan en bois. Boucher le tube solidement jusqu’au premier arrêt, empêchant les déversements tout en permettant l’échange d’air pendant l’incubation.
Ensuite, incubez les tubes de culture dans un tambour à rouleaux pendant 24 heures à une température jugée optimale pour maximiser la croissance des levures. Ensuite, étiqueter les plaques de gélose à base de chloramphénicol et d’extrait de levure supplémenté de bénomyle peptone-dextrose avec l’ID de l’échantillon de sol avant de transférer le surnageant dans le milieu solide. Retirez les tubes de culture du tambour à rouleaux.
Ensuite, à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, vortexz brièvement le tube pour aspirer les particules de sol et les cellules qui peuvent s’être déposées au fond en suspension. Ensuite, transférez 100 microlitres du surnageant sur une plaque à l’aide d’une micropipette. Utilisez un épandeur de cellules réutilisable stérile pour étaler le liquide complètement et uniformément sur la surface de la gélose.
Après avoir prévu un temps d’incubation suffisant de deux à trois jours, inspectez les plaques pour détecter toute croissance de levure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour détecter les organismes de niveau deux. Recherchez des levures crémeuses, rondes et mates qui peuvent être facilement distinguées des colonies bactériennes et de moisissures. Sélectionnez une colonie ressemblant à de la levure dans chaque assiette à l’aide de bâtonnets d’applicateur stériles en bois à pointe unie.
Transférer chaque colonie sélectionnée sur un extrait de levure fraîche des plaques de gélose peptone-dextro complétées par du chloramphénicol et du bénomyl et des stries pour des colonies individuelles. Effectuez trois stries distinctes et utilisez un nouveau bâton applicateur pour chaque traînée. Ensuite, utilisez des cellules fraîches développées sur une plaque pour effectuer une réaction en chaîne de la polymérase de colonie.
Utilisez des aéroteurs transcrits internes ITS1 et ITS4 pour amplifier le gène codant à barres fongiques. Comparez la séquence d’espacement interne transcrite obtenue des souches de levure, deux séquences déposées dans des bases de données publiques, telles que le National Center for Biotechnology Information GenBank et UNITE pour établir l’identité de l’espèce. Ajouter la terre dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de bouillon de dextrose Sabouraud et incuber à 50 degrés Celsius pendant deux à quatre jours.
Pour transférer le mycélium du bouillon inoculé du sol sur des plaques de gélose à l’extrait de malt, identifiez d’abord les inoculums du sol qui ont une croissance mycélienne visible, ajoutez le bouillon de dextrose Sabouraud à la limite de l’air. Ensuite, utilisez des bâtonnets applicateurs en bois stérilisés pour transférer le mycélium au centre d’une plaque de gélose à extrait de malt et incuber ces plaques d’agar à l’extrait de malt à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Pour la sélection du mycélium, avec les propriétés morphologiques d’Aspergillus fumigatus, identifiez les colonies de moisissures qui ont une croissance caractéristique de type balancement vert.
À l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, récoltez les conidies ou les mycéliums en grattant la surface une fois à l’aide de bâtons applicateurs de pointe de plan en bois stérilisés ou d’une boucle d’inoculation et transférez-la au centre d’une plaque de gélose extrait de malt en striant sur la gélose pour les colonies individuelles. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux jours. À l’aide d’un bâton d’application stérile ou d’une boucle d’inoculation, sous-cultiver une seule colonie générée sur une gélose à l’extrait de malt en striant la colonie une fois.
Étalez les spores récoltées au centre de la plaque. Préparez une solution stérile de glycérol à 30% pour récolter les spores d’Aspergillus fumigatus ou le mycélium pour le stockage de la culture. Après les deux jours d’incubation des plaques de gélose à 37 degrés Celsius, aspirer un millilitre de la solution de glycérol à 30% à l’aide d’une pipette et la disperser sur la colonie d’Aspergillus fumigatus.
Pour l’identification phénotypique des souches d’Aspergillus fumigatus, aspirer 10 microlitres des stocks de mycélium et de spores pour ajouter 990 microlitres d’eau. Vortex cette suspension de spores diluées et distribuer 10 microlitres de la suspension sur une lame de microscope standard. Ensuite, à l’aide d’un microscope composé à un grossissement de 400X, visualisez la suspension et localisez les conidiophores.
Comparez la morphologie des conidiophores observée avec la morphologie des conidiophores d’Aspergillus fumigatus. Pour déterminer la taille correcte des fragments pour chacun des neuf loci de micro-satellites, utilisez un logiciel capable d’analyser les fragments. Récupérez les données brutes obtenues par électrophorèse capillaire et notez la taille des fragments en fonction du pic le plus important à l’aide du logiciel d’analyse fragmentée.
Ensuite, convertissez les tailles de fragment en nombres répétés pour chacun des neuf faibles utilisez les tailles de fragment des nombres répétés de la souche de référence Af293. Sur 3 826 échantillons de sol prélevés sur 53 sites dans neuf pays, 1 473 souches de levure ont été isolées. La meilleure température d’incubation pour chaque pays a été déterminée en fonction de sa température annuelle moyenne.
Dans l’analyse de raréfaction pour chaque pays, l’indice de diversité de Shannon a été utilisé comme mesure de la diversité des levures du sol. Les courbes de raréfaction résultantes se sont approchées de l’asymptote de saturation, ce qui indique qu’un échantillonnage supplémentaire n’était pas susceptible d’avoir donné plus de diversité de levure. La croissance mycélienne sur les plaques a formé la morphologie verte oscillante typique d’Aspergillus fumigatus.
D’autres espèces de champignons thermotolérants pourraient être présentes dans le même échantillon de sol et cultiver l’Aspergillus fumigatus sur la même plaque ou par elle-même. La structure conidiophore d’Aspergillus fumigatus vue et identifiée à l’aide de la microscopie optique a révélé que les conidiophores ont une boule sur la morphologie du bâton et que les conidiophores sont unisés, où les phialides attachés aux chaînes de conidies sont attachés directement à la vésicule sphérique. Un bisériement généré par chromatogramme a révélé les trois canaux visualisant les longueurs de fragments d’Aspergillus fumigatus dinucléotide, de trinucléotide et de tétranucléotide courts loci de répétition en tandem.
Un réseau couvrant au minimum de haute qualité peut être généré à l’aide du script R plot_poppr_msn ou imsn. Une analyse discriminatoire des composants principaux est une autre méthode pour visualiser les relations génétiques entre les souches. L’ajout de bénomyl et de chloramphénicol aux milieux de croissance empêche la croissance des moisissures et des bactéries, respectivement, et favorise la sélection des levures.
Le chloramphénicol réduit également la fermentation dans les milieux, réduisant l’accumulation de gaz dans les tubes d’incubation. La réalisation de métagénomiques sur des échantillons de sol fournira des informations supplémentaires sur la diversité culturelle. Des tests sensibles sur les souches d’A.fumigatus permettront d’identifier la présence de génotypes de résistance.
Ce protocole peut être appliqué à d’autres systèmes de levure et de moisissure avec peu de modification. Il a facilité l’étude de la diversité des levures de sol et de ses prédicteurs à l’échelle mondiale.
