Ce protocole est important parce qu’il isole des souches fongiques à fort potentiel de dégradation directement à partir d’échantillons de sol pour être considérées comme candidates à des fins de bioremédiation. Ce protocole est un dépistage peu coûteux pour trouver des champignons ayant un potentiel de bioremédiation. De plus, il donne des résultats faciles à interpréter.
Étant donné que cette technique implique la manipulation de micro-organismes, il est très important de travailler en stérilité à l’aide d’une armoire à flux laminaire ou d’un brûleur Bunsen pour éviter toute contamination. Pour commencer, échantillonnez le sol d’intérêt et tamisez le sol à l’aide d’un maillage de deux millimètres pour enlever les racines et les débris végétaux. Sous une armoire à écoulement laminaire, ajoutez un gramme de terre tamisée dans un tube stérile de 15 millilitres.
Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’eau désionisée stérile pour faire un 10 à la dilution moins un. Agiter le tube horizontalement pendant 30 minutes. Avant que la suspension ne se dépose, prendre un millilitre de 10 à la dilution moins une avec une pipette stérile et le transférer dans un blanc d’eau désionisée de neuf millilitres pour faire 10 à la dilution moins deux.
Vortex la suspension à fond. De même, faites une dilution de 10 à moins trois d’un tube de dilution de 10 à moins deux. Pour le placage des dilutions du sol sur des milieux sélectifs, recueillir 100 microlitres de la dilution 10 à moins trois à l’aide d’une micropipette avec un point stérile et le transférer sur une boîte de Petri à gélose humique.
Répartissez la dilution uniformément sur la surface du plat à l’aide d’un épandeur de cellules stérile, jetable et en forme de L. Préparez quatre à cinq plats de ce type. De même, préparez des plats en lignocellulose à partir d’un tube de dilution de 10 à moins trois.
Laissez la vaisselle sécher à l’air libre pendant 10 à 15 minutes avant d’incuber à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 15 jours. Vérifiez toutes les colonies fongiques présentes pour les similitudes. Si nécessaire, préparez une lame à observer au microscope optique.
Sous une armoire à écoulement laminaire ou à un brûleur Bunsen, isolez chaque souche fongique choisie en retirant doucement une petite partie du mycélium de la colonie avec une aiguille d’inoculation stérile. Transférer la colonie isolée dans un nouveau plat d’agar à l’extrait de malt, ou MEA. Transférer 20 millilitres de Bushnell Haas, ou milieu BH, dans des flacons en verre de 50 millilitres.
Transférer sept millilitres d’eau désionisée dans des flacons de 15 millilitres et ajouter des morceaux de couvercle en verre brisé glissés dans chaque flacon. Stériliser les flacons en autoclavant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour tester la croissance sur la vaseline, ajoutez un millilitre de vaseline à chaque flacon BH de 50 millilitres à l’aide d’une pipette stérile sous l’armoire à écoulement laminaire.
Gardez quelques flacons avec seulement BH comme contrôle négatif. Retirer le mycélium à la surface du milieu de la plaque MEA avec la souche fongique choisie à l’aide d’une aiguille stérile et le transférer dans un flacon en verre de 15 millilitres avec les glissières de couvercle cassées. Agiter le flacon sur un mélangeur vortex pendant deux minutes, en laissant le couvercle cassé glisser pour couper le cube de la colonie fongique, en faisant une suspension.
Inoculez chaque flacon de vaseline avec une suspension de 200 microlitres. Faites deux répliques pour chaque souche fongique. Pour le contrôle négatif, ajouter 200 microlitres de suspension fongique dans le flacon contenant uniquement du milieu BH.
De plus, conservez le flacon avec de la vaseline sans aucune inoculation fongique pour vérifier la contamination du milieu. Incuber les flacons à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après 15 et 30 jours à partir de l’inoculum. Pour tester la croissance sur l’huile moteur usagée, transférez 500 microlitres d’huile moteur usagée sur la boîte de Petri BHA et répartissez l’huile uniformément.
Ensuite, inoculez la plaque avec une souche fongique en recueillant le mycélium des plaques MEA. Pour tester la croissance sur les plastiques, transférez 200 microlitres de suspension fongique dans une plaque de 96 micropuits. Faites trois répliques de la combinaison de déformation fongique et de plastique.
Ajouter 10 milligrammes d’une poudre de plastique différente à chaque puits avec la suspension fongique. Pour le contrôle négatif, ajoutez 200 microlitres de milieu BH au puits avec la suspension fongique. De plus, pour chaque poudre de plastique, remplissez un puits avec 200 microlitres de solution de BH et 10 milligrammes de chaque poussière de plastique pour vérifier la contamination.
Incuber les plaques à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après 15 et 30 jours. Pour le test calorimétrique qualitatif des laccases, préparez un litre de gélose au dextrose de pomme de terre, ou PDA, et autoclavez pendant 20 minutes. Après l’autoclavage, lorsque le fluide a refroidi mais est encore liquide, ajoutez 400 microlitres de guaiacol sous une hotte à flux laminaire et plaquez-le dans des boîtes de Pétri.
Inoculer la plaque de guaiacol PDA avec une souche fongique en recueillant le mycélium de la plaque MEA. Pour les témoins négatifs, préparez des plaques de PDA avec chaque souche fongique et une plaque avec du PDA et du guaiacol. Incuber les plaques à 25 degrés Celsius dans l’obscurité et observez-les après sept jours.
Pour le test qualitatif des estérases, préparez un litre de Tween 80 medium. Ensuite, placez le milieu sur un agitateur magnétique sans chauffer avec une barre d’agitation à l’intérieur du milieu. Après 10 minutes, lorsque tout est fondu, transférer cinq millilitres du milieu dans des flacons stériles de 20 millilitres et un autoclave.
Ajouter 200 microlitres de suspension fongique au flacon moyennement stérilisé Tween 80. Pour le contrôle négatif, ajouter cinq millilitres de milieu BH autoclavé dans un flacon de 20 millilitres. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de suspension fongique au flacon.
Incuber les flacons à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 21 jours et observez-les tous les sept jours. Le pourcentage de souches fongiques capables de se développer sur la vaseline, l’huile moteur usagée et les poudres plastiques comme seule source de carbone avec différents degrés de succès a été évalué. La capacité des champignons à exploiter la vaseline a été évaluée comme la différence de croissance des colonies entre la BH contrôlée et la vaseline contenant.
Près de 75% des souches testées ont pu utiliser la vaseline comme seule source de carbone et 21% ont montré une croissance maximale. La croissance des plaques contenant uniquement du BHA et en présence d’huile moteur a également été surveillée. Près de 90 % des souches se sont développées avec de l’huile moteur usagée, dont 39 % ont affiché une croissance maximale.
La formation d’un halo rouge-brunâtre autour de la colonie fongique indiquait une production plus élevée de laccases et d’autres enzymes ligninolytiques. Environ 60% des champignons ont pu produire des laccases. De plus, 17% des souches ont produit un halo sombre intense autour de la colonie dans le milieu guaiacol.
L’activité des estérases a été évaluée par la formation d’un précipité blanc chez le milieu Tween 80. Près de 60% des souches ont montré une activité des estérases et 13% ont montré une formation de précipité plus élevée. Ce protocole peut être adapté pour dépister les champignons capables de dégrader tout polluant en ajoutant la substance récalcitrante d’intérêt à un milieu de culture minimal.
