Ce protocole est important car il démontre non seulement des approches pour purifier les vésicules de la culture à différentes échelles, des compromis, des différences entre les méthodologies et aussi la prise en compte du travail avec des échantillons de terrain. Les cyanobactéries présentent des défis uniques en matière d’échantillonnage et d’analyse des vésicules. Ces techniques ont réussi à isoler et à concentrer des vésicules issues de cultures et d’échantillons environnementaux.
Pour concentrer des échantillons de moins de 500 millilitres, commencez par rincer les concentrateurs centrifuges à ultrafiltration de 15 à 20 millilitres avec de l’eau de qualité ultrapure de type 1. Chargez les concentrateurs dans la centrifugeuse et faites tourner à 4 400 x g à quatre degrés Celsius. Jetez le run through et répétez l’étape au moins deux fois.
Chargez l’échantillon de surnageant dans un concentrateur rincé à l’eau et tournez-le dans les mêmes conditions. Répétez cette étape jusqu’à ce que l’échantillon soit concentré sur un volume final de 15 à 30 millilitres. Pour concentrer un volume de plus de 500 millilitres, effectuez une filtration tangentielle en installant l’appareil comme décrit dans le manuscrit.
Fixez une pompe péristaltique à la ligne d’admission et placez des pinces réglables sur la ligne de rétentat. Désinfectez la filtration à flux tangentiel comme décrit dans le manuscrit, puis rincez l’appareil avec un litre d’eau ultrapure de type 1. Ajouter moins de 0,2 micron de filtrat dans le réservoir d’échantillon.
Augmentez lentement la vitesse de la pompe et les niveaux de contre-pression sur la conduite de rétentat pour augmenter le rendement des conduites de filtrat. Continuez à faire fonctionner la filtration à flux tangentiel et remplissez le réservoir avec un surnageant de culture au fur et à mesure que le matériau est retiré. Arrêtez de concentrer l’échantillon une fois que le volume dans le réservoir atteint la quantité la plus faible possible nécessaire pour maintenir le débit dans la conduite d’admission sans introduire de bulles d’air.
Fermez la ligne de sortie avec une pince. Retirez la contre-pression sur la ligne de rétentat. Recirculez le surnageant concentré à travers le filtre pendant 10 minutes, réduisant ainsi le taux de recirculation de 20 à 40 millilitres par minute pour maximiser la récupération.
Déplacez la ligne de rétentat dans un récipient propre, retirez la ligne d’admission de l’échantillon et prélevez le matériau concentré. Récupérez tout matériau restant dans le réservoir d’échantillon à l’aide d’une pipette. Filtrer le surnageant concentré à travers un filtre à seringue de 0,2 micron.
Si nécessaire, conservez le concentré final à quatre degrés Celsius pendant environ trois semaines avant de passer à la purification des vésicules. Pour granuler l’échantillon de culture concentré, placez-le dans un tube ultracentrifuge propre et ajoutez un milieu propre ou un tampon pour vous assurer que le tube est rempli. Après centrifugation, retirer le surnageant avec une pipette.
Lavez à nouveau le matériau granulé avec un milieu de culture frais ou un tampon de lavage, tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate 1X et répétez la centrifugation. Remettre en suspension le granulé final en culture fraîche par pipetage doux avec une pipette d’un millilitre et le transférer dans un récipient propre. Pour effectuer l’ultracentrifugation du gradient de densité, préparez des stocks d’iodixanol comme décrit dans le manuscrit.
Mélanger une partie du tampon 4X avec trois parties de bouillon d’iodixanol à 60% pour obtenir une solution d’iodixanol à 45%. Diluer 45% d’iodixanol avec un tampon 1X pour créer des stocks de milieux de gradient de concentrations finales d’iodixanol de 40, 35, 30, 20, 15 et 10%. Ensuite, superposez soigneusement des quantités égales de toutes ces souches de gradient d’iodixanol dans un tube ultracentrifuge, en utilisant tout le volume du tube.
Après centrifugation, recueillir les fractions de 0,5 millilitre chacune pour un gradient d’environ 4,5 millilitres en pipetant soigneusement ou en utilisant un collecteur de fractions. Déterminer la densité de chaque fraction, en grammes par millilitre, à l’aide d’une balance analytique et d’une pipette étalonnée. Retirez l’échantillon du tube, déterminez le poids et retournez l’échantillon dans le tube.
Diluer les fractions individuelles avec un tampon propre dans un nouveau tube suivi d’un milieu propre ou d’un lavage tampon. Appliquez soigneusement cinq microlitres de vésicule et laissez-la reposer pendant cinq minutes. Retirez l’échantillon en touchant le bord d’une grille à un morceau de papier filtre propre.
Pipeter 20 à 50 microlitres d’acétate d’uranyle à 2% sur une surface plane recouverte d’un film plastique. Placez ensuite la grille flottant dessus pendant deux minutes. Retirez l’acétate d’uranyle à l’aide de papier filtre et flottez brièvement sur une goutte d’eau ultrapure pour le laver.
Remplissez la chambre d’eau ultrapure à l’aide d’une seringue propre et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Cliquez sur démarrer la caméra et visualisez la région optimale de la chambre autour de l’empreinte du pouce. Faites glisser les curseurs de gain d’écran et de niveau de caméra vers le maximum, puis diminuez jusqu’au niveau le plus bas pour voir les particules les plus faibles.
Ajustez la mise au point si nécessaire pour vous assurer que les particules sont à peu près également visibles dans le champ de vision et continuez à laver avec de l’eau ultra propre jusqu’à ce que la chambre soit propre. Ajouter l’échantillon de vésicule à la chambre à l’aide d’une seringue d’un millilitre et confirmer les paramètres d’acquisition. Sélectionnez mesure standard dans la liste déroulante SOP et modifiez les paramètres pour collecter au moins trois répliques techniques de vidéos de 60 secondes chacune.
Appuyez sur create 'and run script' et suivez les instructions et poussez environ 100 microlitres d’échantillon dans la chambre entre les réplications. Déterminez les paramètres des particules en cliquant sur analyse et ouvrez l’expérience et chargez le fichier d’échantillon. Sélectionnez traiter les fichiers sélectionnés et attendez la fin de l’analyse.
L’isolement et la caractérisation des vésicules extracellulaires de la cyanobactérie Synechocystis sp. PCC6803, ont montré que la membrane externe contient des carotinoïdes, qui confèrent une coloration orange caractéristique aux échantillons de vésicules prélevés par granulation directe par ultracentrifugation. La pastille de vésicule remise en suspension a été examinée par microscopie électronique à transmission, soit en colorant négativement des échantillons avec de l’acétate d’uranyle, soit en observant des sections ultraminces.
La distribution de la taille et la concentration des vésicules ont été évaluées à l’aide d’analyses de diffusion dynamique de la lumière et de suivi des nanoparticules. Les vésicules purifiées de Synechocystis sp. PCC6803 ont été séparées sur un gel de dodécysulfate de sodium-polyacrylamide et colorées pour les lipopolysaccharides.
Des échantillons doivent être prélevés avant et après l’échantillon de vésicules concentrées pour s’assurer que la filtration à flux tangentiel fonctionne et que les vésicules se concentrent. Ensuite, vous devez mesurer les deux échantillons à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules. Des efforts futurs sont nécessaires pour fusionner cette méthode avec d’autres approches telles que la chromatographie d’exclusion de taille ou le fractionnement asymétrique en flux de champ afin d’améliorer la discrimination et l’isolement des petites particules des échantillons de culture et environnementaux.
Cette technique est utile pour étudier les vésicules de cyanobactéries et les rôles fonctionnels spécifiques de ces vésicules en biologie cyanobactérienne.
