La séparation des vésicules extracellulaires des fluides tels que les milieux de culture cellulaire peut permettre aux chercheurs de caractériser la cargaison vesticulaire et d’explorer leurs mécanismes de communication intracellulaire. Cette technique permet une séparation suffisante des VE et des protéines extracellulaires des milieux de culture cellulaire conditionnés qui est simple et conviviale. Pour commencer, placez PBS dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.
Observer les flacons de culture cellulaire témoins et traités à la tunicamycine sous un microscope composé avec une lentille d’objectif 10 x et 100 x. Prendre note de toute différence entre les flacons. Retirez le milieu de la fiole et placez-le dans un tube de 50 millilitres.
Ensuite, centrifuger le tube à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Centrifuger le tube à 2000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le super nageant dans un nouveau tube et placer le tube sur de la glace.
Prenez quatre unités d’ultrafiltration de coupure de 15 millilitres et trois kilodaltons et ajoutez cinq millilitres de PBS à chaque tube. Amorcez les filtres en centrifugeant les unités à 4 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le PBS des unités, diviser le surnageant du témoin et des conditions traitées en deux unités d’ultrafiltration contenant chacune environ 12,5 millilitres de fluide.
Centrifuger les tubes à 4 000 g pendant une heure 45 minutes à quatre degrés Celsius ou jusqu’à ce que le milieu concentré ou le rétentat dans chaque unité soit concentré à 250 microlitres ou moins. Transférer le rétentat des deux unités de contrôle dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre marqué et des unités traitées dans un autre tube. Mesurer le volume total du rétentat dans chaque tube microcentrifugé.
Si le volume est inférieur à 500 microlitres, ajoutez du PBS filtré de 0,22 micron jusqu’à ce que le volume final soit de 500 microlitres. Placez les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Activez le collecteur automatique de fractions ou AFC.
Retirez la colonne de quatre degrés Celsius et laissez-la se réchauffer à température ambiante. Retirez les échantillons de rétention du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace pour les décongeler, en attendant, placez huit tubes étiquetés de 1,5 millilitre dans le carrousel AFC avec les couvercles orientés vers l’intérieur. Insérez la colonne dans l’AFC avec le code-barres face au lecteur et ajustez les paramètres pour collecter huit fractions de 500 microlitres chacune et le volume tampon par défaut.
Vérifiez ensuite les instructions à l’écran pour démarrer la collecte. Une fois que le tampon de stockage est complètement absorbé dans la partie supérieure de la matrice de colonnes. Commencez à rincer la colonne en ajoutant 15 millilitres de PBS à la colonne.
N’ajoutez pas de PBS trop tôt car cela diluerait le tampon de stockage et empêcherait un rinçage adéquat. Juste avant que les 15 millilitres de PBS ne soient absorbés par la matrice, cliquez sur OK pour arrêter le rinçage et enlever tout PBS résiduel du haut de la matrice colonne avec une micro-pipette. Ne touchez pas à la matrice.
Ajoutez 500 microlitres d’échantillon au centre de la colonne et cliquez sur OK pour commencer l’exécution. Une fois que l’échantillon est complètement absorbé dans la matrice, ajoutez immédiatement huit millilitres de PBS à la colonne. AFC dissipe automatiquement le volume vide au centre du carrousel avant de collecter les huit fractions de 500 microlitres chacune.
Après la course, retirez les fractions du carrousel et placez-les sur la glace. Retirez ensuite le volume vide du centre du carrousel. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBS à la colonne pour laver tout échantillon résiduel de la colonne.
Et une fois que l’échantillon repenti a été complètement rincé, ajoutez 15 millilitres de PBS à la colonne. Au fur et à mesure que le PBS final est absorbé par la matrice, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,5 molaire au centre de la matrice de la colonne. Ensuite, lorsque l’hydroxyde de sodium est absorbé, ajoutez 30 millilitres de PBS à la colonne et laissez-la rincer.
Une fois tous les échantillons terminés, conservez la colonne pour une utilisation ultérieure en ajoutant 15 millilitres d’azoture de sodium à 0,05% à la colonne. Laissez environ cinq millilitres d’azoture de sodium sur le dessus de la matrice de colonne. Retirez la colonne de l’AFC et fixez les capuchons supérieur et inférieur avant de placer la colonne à quatre degrés Celsius pour le stockage.
Construire l’unité d’ultrafiltration. Obtenir deux millilitres, trois unités d’ultrafiltration de coupure de trois kilodaltons par échantillon. Chaque unité est composée de trois parties, cône, filtre et cylindre à flux.
Étiquetez chaque partie correctement. Ajouter un millilitre de PBS à la partie filtrante et bouchonner avec la pièce conique. Centrifuger le cône de l’unité d’ultrafiltration vers le haut à 3 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et retirer le PBS filtré du cylindre à écoulement.
Retournez l’unité d’ultrafiltration et centrifugez pendant deux minutes à 1000 G à quatre degrés Celsius pour éliminer le PBS restant. Combinez quatre 500 microlitres de chaque fraction et ajoutez-les à l’unité d’ultrafiltration. Ensuite, les colonnes de centrifugeuses coïncident pendant une heure, 45 minutes à 3 500 G à quatre degrés Celsius ou jusqu’à ce que le niveau de rétention soit à 100 microlitres.
Retirez le cylindre d’écoulement et jetez le flux traversant. Retournez l’unité d’ultrafiltration et centrifugez pendant deux minutes à 1000 XG à quatre degrés Celsius. Transférer le rétentat dans le cône dans un tube de 1,5 millilitre et porter le volume de l’échantillon à 150 microlitres avec du PBS filtré de 0,22 micron avant de placer les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Un bloc occidental représentatif de fractions individuelles a montré une forte expression de CD9, CD63 et CD81. Infractions de un à quatre avec peu ou pas d’infractions d’expression cinq à huit. Aucune expression de GM130 ou de calnexine n’a été observée dans aucune fraction.
L’albumine n’était présente que par fractions six à huit. L’efficacité de la concentration des fractions EV et protéique a également été évaluée. L’expression de CD9 et CD63 a été observée dans les lysats cellulaires.
Les trois protéines CD étaient présentes dans les fractions EV des échantillons témoins et traités à la tunicamycine, mais pas dans les fractions protéiques. Le gène de susceptibilité tumorale 101 était présent dans les lysats cellulaires, mais pas dans les fractions EV ou protéiques. Le GM130 et la calnexine n’ont été observés que dans les lysats cellulaires.
Dans le Western blot des milieux de culture cellulaire appauvris en exosomes, les marqueurs EV étaient présents dans les lysats cellulaires, mais pas dans les échantillons de milieux. L’expression de l’albumine a été observée dans les fractions protéiques et l’expression minimale dans les lysats cellulaires. Les observations TEM ont démontré des structures sphériques dans les fractions EV des échantillons témoins et traités à la tunicamycine.
Ces structures n’ont pas été observées dans les fractions protéiques des deux types d’échantillons. L’analyse de suivi des nanoparticules révèle des différences dans les concentrations de particules des fractions témoins et traitées dans les fractions EV par rapport au contrôle, un peu plus de particules étaient présentes dans le traitement à la tunicamycine. Cependant, dans les fractions protéiques, moins de particules ont été détectées par rapport aux VE.
Il est important d’avoir le même volume d’échantillon pour les conditions de contrôle et traitées, ce qui permet de comparer facilement les VE des différents traitements. Après avoir séparé les VE des milieux de culture cellulaire de la condition, nous pouvons caractériser la teneur en protéines, ARN et lipides des vésicules avec le séquençage protéomique de l’ARN et la lipidomique.
