Transplantation de microglies dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive

Ce protocole permet une transplantation non invasive d’iPSMG dans le cerveau immunocompétent de souris en combinant l’activation / désactivation pharmacologique d’un antagoniste du récepteur CSF1 PLX5622 avec une transplantation transnasale. Le principal avantage de cette technique est que l’iPSMG peut être transplanté sans induire de lésions cérébrales, même chez les souris immunocompétentes. La transplantation microgliale peut servir de thérapie potentielle pour échanger des microglies dysfonctionnelles avec des microglies fonctionnelles dans diverses maladies neurodégénératives à l’avenir.

Bijay Parajuli, un chercheur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par décongeler rapidement les cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites congelées dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Faites tourbillonner les échantillons jusqu’à ce que toute la glace visible ait fondu.

Ajouter l’iPSMG décongelé au milieu de culture, réchauffé à 37 degrés Celsius. Ajouter un millilitre de cellules à 10 millilitres de milieux de culture. Centrifugez les cellules à 300 fois g pendant cinq minutes pour obtenir une pastille de cellule.

Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ajouter le milieu de transplantation pour obtenir une concentration cellulaire de 10 à la cinquième cellule par microlitre. Placez l’iPSMG sur la glace et procédez immédiatement à la transplantation.

Pour préparer les souris à la transplantation transnasale, nourrissez les souris mâles avec un régime contenant du PLX pendant sept jours. À la fin du septième jour, cessez le régime PLX et nourrissez les souris avec un régime normal. Une heure avant la transplantation transnasale d’iPSMG, administrer 2,5 microlitres de hyaluronidase dans le PBS à chaque narine deux fois à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres pour augmenter la perméabilité à la muqueuse nasale.

Placez les souris en position couchée après l’application de hyaluronidase. Administrer 2,5 microlitres de hyaluronidase dix minutes avant la transplantation transnasale d’iPSMG. Appliquez 2,5 microlitres de suspension cellulaire dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres.

Placez la souris en position couchée pendant cinq minutes avant d’administrer une suspension cellulaire à l’autre narine. Administrer la suspension cellulaire quatre fois, en appliquant un volume total de 20 microlitres par animal. 48 heures après l’arrêt de l’alimentation PLX, répétez l’administration de hyaluronidase et de suspension cellulaire sur les mêmes souris.

Pour l’administration de cytokines, appliquer 2,5 microlitres du milieu de transplantation dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres. Après deux mois de transplantation transnasale, le nombre de cellules transplantées peut être déterminé en comptant les cellules positives pour les marqueurs spécifiques à l’homme et panmicrogliaux. Les microglies endogènes de souris sont positives pour le marqueur pan-microglial uniquement.

Chez les souris témoins, seules des microglies de souris ont été détectées dans le cortex et l’hippocampe. Dans le cortex des souris transplantées iPSMG, seules des microglies de souris ont été détectées, tandis que dans l’hippocampe, des iPSMG ont été détectées. Lors de la tentative de ce protocole, l’élimination complète du surnageant est essentielle pour prévenir la dilution des cytokines.

Il est crucial d’appliquer des cytokines toutes les 12 heures pour la viabilité des cellules transplantées. L’épuisement de la microglie endogène de la souris est nécessaire pour la transplantation d’iPSMG. Cette procédure permet la transplantation d’iPSMG dans un cerveau de souris normal ou malade.

Ainsi, la caractéristique de l’iPSMG ainsi que la réponse à la maladie peuvent être déterminées. Cette technique est appropriée pour déterminer la caractéristique in vivo de l’iPSMG dans le cerveau de la souris. Ainsi, la transplantation d’iPSMG dans des souris modèles de maladie nous aidera à comprendre la réponse et pourrait ouvrir la voie à une nouvelle cible thérapeutique.