1. Préparation <ol><li> Préparer xylazine-kétamine solution (kétamine est une substance contrôlée. Registres détaillés doivent être conservés et stockés dans des solutions un endroit sûr et verrouillé). </li><li> Nettoyer et stériliser le matériel. </li><li> Préparer aire d&#39;opération en essuyant avec un agent d&#39;asepsie et ensuite recouvrir de papier essuie-stériles, et mis en place le micromanipulateur. </li></ol> 2. Préparation des cellules pour la transplantation <ol><li> Les cellules doivent être remises en suspension à une concentration de 100 000 cellules / l E et, bien que seulement 250 000 cellules sont transplantées par souris, un excès de cellules est nécessaire à des fins de chargement seringue (préparer au moins 300 000 cellules par souris recevant des cellules). </li><li> Laver les cellules à transplanter 3 fois dans HBSS dans un flacon conique de 50 ml. Compter les cellules avant l&#39;essorage final. </li><li> Après l&#39;essorage final vers le bas, et de laisser décanter HBSS flacon à l&#39;envers position pour empêcher les gouttelettes d&#39;atteindre le culot. </li><li> L&#39;intérieur des murs à sec avec un rayonnement UV-irradiés, Kimwipe stérile. Ne laissez pas le culot de sécher. </li><li> En tenant le tube debout, lentement et très délicatement remettre en suspension les cellules dans la moitié du volume final désiré de HBSS. </li><li> Mesurez le volume total par pipetage la majorité de la suspension dans un embout de pipette puis en réglant le cadran sur le pipetteur jusqu&#39;à la suspension totale est dans la pointe de la pipette. Cela vous indiquera combien plus HBSS est nécessaire pour la concentration voulue. </li><li> Amener le volume à la quantité désirée en ajoutant HBSS. </li><li> Remettre sur la glace. Vérifiez la viabilité des cellules si elles doivent être sur la glace pendant plus de 2 heures. </li></ol> 3. Préparation de la souris pour la chirurgie et la transplantation <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine (100mg/kg) et de xylazine (10mg/kg) dans ~ 100 doses ul ou un équivalent anesthésique. L&#39;ensemble de la procédure de préparation chirurgicale pour suture prendra 30-40 minutes. </li><li> (Facultatif: appliquer numérotées, un ruban de couleur à la queue de chaque souris pour assurer l&#39;identification) </li><li> Rasez la zone dorsale de la souris à partir du bas du dos à la nuque, et l&#39;extension de 2 cm de la ligne médiane bilatérale, avec une tondeuse électrique. Les cheveux doivent être coupés aussi près que possible (il peut être nécessaire d&#39;aller sur la zone plusieurs fois). </li><li> Pour enlever les poils restants, appliquer une fine couche de crème dépilatoire (Nair) avec une gaze applicateur incliné. </li><li> Après 1-2 minutes, essuyez Nair avec une gaze humidifiée légèrement avec de l&#39;eau savonneuse. La zone préparée doit être propre peau nue sans aucun morceaux errants de cheveux qui pourrait entrer dans la plaie lors de la procédure subséquente chirurgicale. Stériliser la zone préparée avec une solution d&#39;iodure. </li></ol> 4. Laminectomie <ol><li> Changez fréquemment et / ou de stériliser les gants pendant toute la procédure. Placez le côté de la souris dorsale avec la tête pointant vers la gauche (si vous êtes droitier). Drapé des animaux pour assurer la stérilité et que seule la zone rasée est exposée. Faire une incision verticale (~ 1,3 cm) sur le site laminecomy allant de quelque vertèbres thoraciques T8 à T12. </li><li> Avec la pince Graefe tenu dans la main gauche, de fixer solidement la colonne vertébrale au T9 (figure 1A) et soulevez la souris vers le haut à exagérer la courbure rachidienne. </li><li> Utilisez le scalpel pour marquer la jonction entre T10 et T11, l&#39;espace entre les deux protubérances épineuses. En outre exposer la jonction par attentivement la mise au rebut de la couche musculaire pour exposer l&#39;os (voir figure 1B, C). </li><li> Utilisez les ciseaux pour les muscles encore claires loin de la lame et autour du pédicule avec des cisailles de petite taille. Cela permettra d&#39;ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Lentement et délicatement insérez une lame des ciseaux dans cet espace et couper le pédicule. Assurez-vous que la courbure de la paire de ciseaux est toujours positionné latéralement, loin de la moelle. Répétez de l&#39;autre côté. (Voir Figure 1D, E) </li><li> Soulevez la lame d&#39;exposer le cordon et soigneusement coupez. Soyez sûr de ne pas laisser des fragments d&#39;os gratuits ou déchiquetés derrière. (Voir Figure 1F) </li><li> Avant l&#39;injection, nettoyer tout le sang loin avec des cotons-tiges stériles. </li></ol> 5. L&#39;injection de cellules <ol><li> Fixez l&#39;aiguille avec une aiguille de noix à la seringue de Hamilton et les nettoyer en rinçant plusieurs fois avec de l&#39;eau, puis 70% d&#39;éthanol, et enfin HBSS. Insérez le piston après chaque remplissage avec de l&#39;eau, l&#39;éthanol à 70%, ou HBSS. </li><li> Préparez la seringue Hamilton pour le chargement de la cellule en retirant le piston et desserrant l&#39;écrou d&#39;aiguille et en tirant l&#39;aiguille de la seringue de suite pour éviter la contre-pression. Assurez-vous que la manipulation soigneuse de l&#39;aiguille et l&#39;écrou sont fait avec des gants stériles. </li><li> Charge 15μl de cellules dans la pointe de pipette et appuyez sur la pointe solidement dans l&#39;extrémité arrière de la seringue pour charger les cellules dans la seringue. </li><li> Insérez le piston de 5mm environ et puis serrer l&#39;écrou de l&#39;aiguille. </li><li> Enfoncer le piston de l&#39;ONUjusqu&#39;à ce certains de la suspension cellulaire est vu sortir l&#39;aiguille. </li><li> Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles dans la seringue et jeter la seringue en position horizontale pour empêcher les cellules de faire un dégradé par la gravité. </li><li> Prends de la souris laminectomized par le muscle dorsal spinalis reliant les épines de T8 et T9 (figure 2B, C). </li><li> Pince hémostatique l&#39;au bras micromanipulateur (vertical) gauche de sorte que les pattes avant de la souris sont dans l&#39;air et ses pattes arrières touchant légèrement une plate-forme de serviettes en papier stériles comme dans les figures 2A et 2B. </li><li> Fixer la seringue dans le bras droit de micromanipulateur (à un angle de 70 °) et faites glisser la seringue à la position la plus basse possible, avant le serrage. </li><li> Stabiliser la souris en épinglant sa queue contre les serviettes en papier et abaissez lentement la seringue (figure 2B). </li><li> Abaissez l&#39;aiguille vers le cordon et insérez le 1mm aiguille dans l&#39;hémisphère opposé à la ligne médiane dorsale (figure 2C). La pointe de l&#39;aiguille doit être dans la matière grise à proximité du canal central. </li><li> Injecter lentement 2.5μl de cellules. Injecter à un taux de 1 microlitre / 5 secondes. Après l&#39;injection des cellules, attendez 10 secondes et une rétraction de l&#39;aiguille d&#39;un dixième de tour à la fois toutes les 10 secondes jusqu&#39;à ce que l&#39;aiguille est hors de la moelle. Prêtez attention à efflux possible de cellules en suspension. </li><li> Rentrer rapidement la seringue et le détacher de la branche micromanipulateur. Poser la seringue vers le bas à l&#39;horizontale. </li><li> Relâchez la souris et le transfert à la table de suture. </li><li> Répétez les étapes 5.7 à 5.14 pour chaque souris jusqu&#39;à ce que la seringue est vide. Stériliser les outils (dans le stérilisateur) et l&#39;aiguille (en essuyant avec de l&#39;éthanol) entre les animaux. Jeter les cellules et recharger si l&#39;agglutination est visible. </li><li> Nettoyer la seringue à l&#39;étape 5.1 entre les charges. </li></ol> 6. Sutures et les soins post-op <ol><li> Suture de l&#39;incision. Aiguille à suture est insérée dans l&#39;aponévrose superficielle des deux côtés de l&#39;incision. Le fil est tendu à travers, tirant fascia superficiel ensemble (figure 3A), couvrant ainsi le cordon médullaire exposées sur le site de la lame enlevée. Ne pas suturer le muscle cutanée attaché à la peau ou les muscles squelettiques du dos. Tirer le fil entier à travers, en laissant environ 1 / 2 &quot;. Utilisation du porte-aiguille, trois noeuds sont formés et le fil est coupé au plus près du noeud que possible. </li><li> Fermer l&#39;incision par l&#39;application de deux à trois agrafes (selon la taille de l&#39;incision) à la peau (figure 3B). Retirez soigneusement la peau loin de la souris afin d&#39;éviter l&#39;agrafage du muscle sous-jacent. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 26G3 / 8 aiguilles d&#39;injecter 0,5 ml de Ringer sous-cutanée dans le bas du dos loin de l&#39;incision. </li><li> Placez la souris au retour dans sa cage. Afin de s&#39;assurer qu&#39;il est capable de respirer confortablement sous anesthésie, la souris doit être placée sur le côté dans la cage, en évitant tout contact entre le site de la chirurgie et de la literie cage. Les cages devraient être placées sur des coussins chauffants. </li><li> Les souris sont surveillés après l&#39;anesthésie s&#39;estompe pour assurer s&#39;apaise saignements, les sutures restent fermés, et que les souris retourner au pré-opératoire de la mobilité. </li><li> Traiter les souris une seule fois avec la buprénorphine analgésique (0,05-0,1 mg / kg) après une chirurgie. </li><li> Assurez-souris avec facultés affaiblies ont un accès suffisant à la nourriture et l&#39;eau: bouteilles d&#39;eau sont équipés d&#39;étendue 3,5 pouces becs et des souris qui sont incapables de marcher sont nourris à la main l&#39;eau et / ou à haute teneur en calories des compléments alimentaires (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Les résultats souhaités seront identifiables par l&#39;absence d&#39;efflux de la suspension cellulaire lors de l&#39;injection et par l&#39;aspect intact de la moelle épinière suite à la procédure. À cette fin, il est vital d&#39;avoir un éclairage lumineux et direct sur la colonne vertébrale de la souris lors de la laminectomie et pendant l&#39;injection. Éclairage optimal est facilitée par l&#39;éclairage à fibres optiques (figure 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1 - Laminectomie (A) Une fois vertèbre T9 est solidement tenu avec la pince de Graefe, (B, C) ​​Score de la colonne vertébrale avec un scalpel entre T10 et T11 pour faciliter l&#39;entrée des ciseaux micro.. (D) Faites glisser les ciseaux micro travers l&#39;espace entre T10 et T11 (flèches et en médaillon, E) et couper les pédicules de chaque côté (tirets, E) pour libérer la lame dorsale. (F) Flip la lame jusqu&#39;à rostralement et le couper. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. L&#39;injection de NSC. (A) La configuration générale de l&#39;micromanipulateur avec le hémostatique tenant la souris attaché au bras gauche et la seringue Hamilton sur le bras droit à un angle de 70. (B) Le hémostatique maintenir le muscle dorsal spinalis reliant les épines de T8 et T9. (C) L&#39;aiguille est abaissée à tIl médiane et dans la matière grise dans l&#39;hémisphère opposé, proximale du canal central. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Sutures et fermeture de la plaie. (A) Les sutures sont appliqués à l&#39;aponévrose superficielle des deux côtés de l&#39;incision. (B) L&#39;incision est refermée avec 2-3 agrafes au besoin (une agrafe montré sur une plaie nécessitant 3).

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Une greffe bien exécuté dépendra principalement de la laminectomie prudent et l&#39;injection des cellules. L&#39;écueil principal à éviter lors d&#39;une laminectomie est l&#39;endommagement de la moelle épinière. Cela peut se produire lors de la procédure elle-même ou par les dommages causés par des fragments d&#39;os pointus laissés après la procédure. Pour éviter ces derniers, s&#39;assurer que les points de la micro-ciseaux courbes sont toujours opposée à la corde et d&#39;examiner attentivement la colonne vertébrale laminectomized pour s&#39;assurer que tous les fragments d&#39;os sont effacés et que les bords de la structure restante vertébrale n&#39;a pas ouvertement en saillie ou dentelés. Comme mentionné précédemment, la détection de l&#39;efflux sera possible que si la lumière brille et directement sur le cordon médullaire exposés lors de l&#39;injection. Efflux est le plus susceptible de se produire avec 30 aiguilles de calibre (contre 33 gauge) et si l&#39;injection est faite trop rapidement. Bien que ce protocole nous a donné de bons résultats, d&#39;autres ont rapporté plus les périodes d&#39;attente (jusqu&#39;à 5 minutes) avant de se rétracter l&#39;aiguille d&#39;injection suivante 8,9. Aussi, des aiguilles de calibre plus petit est préférable, mais nous avons constaté que certaines cellules sont lysées trop facilement quand on lui passe au travers de 33 aiguilles de calibre. Afin de maximiser l&#39;efficacité, une équipe de transplantation effectifs des quatre stations différentes (souris prep, laminectomie, une injection, et les sutures) est souhaitable. Par ailleurs, le timing pour chaque procédure doit être optimisé pour minimiser le temps, les cellules sont en attente sur la glace. Par exemple, nous greffe nos souris en groupes de quatre (le nombre de doses de chaque chargement de la seringue), la personne l&#39;injection des cellules commence à charger la seringue après la souris tiers a été laminectomized et la personne qui prépare les souris devrait anesthésier les suivants groupe après la deuxième souris du groupe précédent a été laminectomized. De cette manière, nous pouvons transplanter des cellules (ou le contrôle des médias) dans 40 souris en environ 3 heures, même si chaque souris prendra min environ 30-40. Les thérapies de remplacement cellulaire pour le traitement de certains troubles du SNC sont actuellement en essais cliniques 10. Il n&#39;ya pas de substitut à des modèles in vivo de NSC transplantation et notre protocole pour la prise de greffe de NSC dans la moelle épinière des souris avec une démyélinisation induite virale facilite l&#39;utilisation d&#39;un modèle important de la SEP et peuvent également être facilement adapté à d&#39;autres modèles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Pharmaceutiques </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de xylazine </td><td> MP Biomédical </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ul seringue Hamilton w / amovible aiguilles </td><td> Hamilton Company </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles Hamilton, 30G ou 33 G, ½ pouces, 30 ° conique </td><td> Hamilton Company </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Test de la viabilité des cellules de votre passage suivant à travers des aiguilles d&#39;identifier la meilleure mesure à utiliser </td></tr><tr><td> Micro Ciseaux </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Petite Pince Graefe </td><td> TSF </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stéréotaxique </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modèle 1772 Support Universel </td><td></td></tr><tr><td> Stéréotaxique </td><td> KOPF Instruments </td><td> Titulaire d&#39;électrode Modèle 1773 </td><td></td></tr><tr><td> Stéréotaxique </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modèle 902 stéréotaxique du petit animal </td><td></td></tr><tr><td> Stéréotaxique </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modèle 960 porte-électrode gauche </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Fine Science </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hémostatique </td><td> TSF </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpels, tailles 10,11 </td><td> Fisher </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> Taille 5-0, 3 / 8 &quot;cercle, l&#39;aiguille de 19mm, fil tressé 45cm </td></tr><tr><td> Reflex 7 applicateur clip de la plaie </td><td> TSF </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm clips plaies Reflex </td><td> TSF </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-aiguille Olsen Hegar </td><td> TSF </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Les souris infectées avec la souche JHM neurotrope du virus de l&#39;hépatite de la souris (MHV) de développer les résultats pathologiques et cliniques similaires aux patients atteints de la sclérose multiple maladie démyélinisante (SEP). Nous avons montré que la transplantation de NSC dans la moelle épinière des souris malades les résultats à une amélioration significative dans les deux remyélinisation et de résultats cliniques. Les thérapies de remplacement cellulaire pour le traitement des maladies chroniques neurologiques sont désormais une réalité et dans des modèles in vivo sont essentielles dans la compréhension des interactions entre les cellules greffées et microenvironnement du tissu hôte. Cette présentation fournit une méthode adaptée de transplantation de cellules dans la moelle épinière des souris infectées JHMV. En bref, nous offrons une procédure pour i) la préparation des CNS avant la greffe, ii) soins pré-opératoires de la souris, iii) l&#39;exposition de la moelle épinière par l&#39;intermédiaire laminectomie, iv) l&#39;injection stéréotaxique du CNS, et iv) soins post-opératoires .

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Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

La transplantation de cellules souches neurales de souris (CNS) dans la moelle épinière des souris avec une démyélinisation établi est détaillée. La préparation du NSC, la laminectomie de vertèbre thoracique 9 (T9), et la transplantation d&#39;NSCs est décrite avec les soins pré-et post-opératoire de la souris.

Transplantation chirurgicale de cellules souches neurales de souris dans la moelle épinière des souris infectées avec le virus de l&#39;hépatite murine neurotrope

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K vues.  University of California, Irvine. La transplantation de cellules souches neurales de souris (CNS) dans la moelle épinière des souris avec une démyélinisation établi est détaillée. La préparation du NSC, la laminectomie de vertèbre thoracique 9 (T9), et la transplantation d'NSCs est décrite avec les soins pré-et post-opératoire de la souris.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Recherche

Neurosciences

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Transplantation de Homochronic des interneurones précurseurs dans cerveau de souris postnatale précoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation de progéniteurs interneuron corticales génétiquement modifiés dans les cerveaux de souris postnatales précoces

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...