Ce protocole étend le test très courant des plaies par égratignures utilisé pour les études de régénération avec des monocouches dérivées d’entéroïdes représentant tous les principaux types de cellules de l’intestin grêle. Cette technique permet de visualiser en temps réel la fermeture de la plaie dans un modèle monocouche entéroïde 2D prématuré de régénération intestinale. Notre technique peut être appliquée à l’étude de l’intestin des mammifères prématurés, qui est généralement mal modélisé à l’aide de lignées cellulaires transformées de cancer colorectal.
Commencez par décongeler 96 microlitres de matrice extracellulaire, ou BME d’hydrogel à base d’ECM, pendant la nuit sur de la glace à deux à huit degrés Celsius. Diluer l’hydrogel à base d’ECM et le PBS glacé sans calcium ni magnésium dans un rapport de un à 50. Enduisez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits avec 200 microlitres d’hydrogel à base d’ECM dilué glacé et incuber la plaque enduite pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Aspirez ensuite le média de la plaque de culture de 24 puits contenant les entéroïdes 3D destinés aux monocouches et remplacez-le par 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire par puits. Perturbez manuellement les dômes d’hydrogel à base d’ECM en pipetant de haut en bas huit à 12 fois et en transférant le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les 12 puits vides avec 250 microlitres de réactif de dissociation cellulaire pour vous assurer que tous les entéroïdes ont été éliminés et transférez le contenu dans des tubes coniques de 15 millilitres.
Centrifuger les tubes coniques à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Ajouter 10 millilitres de tampon de lavage DMEM/F-12 glacé aux tubes coniques et suspendre les pastilles entéroïdes en retournant les tubes. Centrifuger à 300g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant.
Remettez en suspension les granulés cellulaires dans 12 millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius et placez les tubes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules semblent solubles. Ajouter trois millilitres de tampon de lavage DMEM / F-12 à chaque tube pour diluer la trypsine-EDTA. Mélanger en inversant les tubes et placer sur de la glace.
Filtrer les entéroïdes dissociés à travers une crépine à mailles de 37 micromètres. Recueillir le contenu dans des tubes coniques propres de 15 millilitres et centrifuger les tubes à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant des tubes coniques et remettez en suspension les pastilles de la cellule avec six millilitres de HOMGY.
Ensuite, retirez la plaque enduite d’hydrogel à base d’ECM de l’incubateur et aspirez tout excès de solution d’hydrogel à base d’ECM sans rayer la surface revêtue ou sécher complètement la plaque. Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire combinée HOMGY de 12 millilitres dans chaque puits de la plaque de 24 puits recouverte d’hydrogel à base d’ECM. Faites tourner la plaque avec le couvercle pour assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en échangeant les milieux HOMGY tous les deux jours jusqu’à ce que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence. Une fois que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence, aspirez le support pour éliminer toutes les cellules qui ne parviennent pas à se fixer. Traiter les cellules avec 500 microlitres de HA35 ou de PBS dissous dans HOMGY pendant 24 heures.
Après cela, retirez le support sans perturber la surface de la monocouche. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, effectuez une rayure linéaire sur tout le diamètre de surface de la monocouche dans chaque puits, en prenant soin de ne pas laisser sécher les monocouches. Lavez les monocouches rayées une fois avec 500 microlitres de 1X PBS et ajoutez 500 microlitres de HA35 ou PBS dissous dans HOMGY.
Transférez la plaque à l’instrument d’analyse de cellules vivantes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Sous l’icône Planifier dans le logiciel d’analyse de cellules en direct, cliquez sur l’icône Assistant Lancer l’ajout d’un nouveau navire. Sélectionnez Analyser selon le calendrier, puis cliquez sur Suivant.
Sélectionnez Nouveau sous Créer un vaisseau et cliquez sur Suivant, puis sélectionnez Puits entier sous Type de numérisation et cliquez sur Suivant. Choisissez Phase pour les canaux d’image et 4x pour l’objectif. Sélectionnez le fabricant de la plaque et le numéro de catalogue dans la liste fournie et cliquez sur Suivant.
Sélectionnez un emplacement de navire vide suivi du modèle de balayage souhaité. Entrez le nom de la plaque dans Nom, puis sélectionnez plus pour créer une disposition de plaque. Sélectionnez petit plus pour créer un nom de traitement.
Entrez le nom court, puis OK. Mettez en évidence les puits à plaques correspondant à ce traitement et frappez grand plus pour désigner les puits avec ce traitement. Entrez la concentration du composé et cliquez sur OK. Lorsque la plaque est terminée, sélectionnez OK, Suivant. Sélectionnez Reporter l’analyse à plus tard, puis Créer une nouvelle planification avec des analyses à des intervalles de quatre heures.
Arrêtez l’analyse à un jour, zéro heure. Assurez-vous que le résumé est correct, puis ajoutez-le à la planification. Dans le logiciel d’analyse de cellules dynamiques, sélectionnez Afficher en haut de l’écran.
Dans le menu Nom du navire, accédez à votre analyse terminée sur 24 heures et double-cliquez sur le nom du navire. Sélectionnez l’icône Exporter les images et les films sur la gauche, suivie de l’option Comme affiché. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt, puis sélectionnez les points d’intérêt temporels et la série d’images affichée.
Assurez-vous que le type de séquence et les analyses sont corrects. Sélectionnez l’emplacement du dossier cible souhaité. Choisissez JPEG dans le menu déroulant, puis Exporter.
Ouvrez le logiciel ImageJ et téléchargez l’image du test de la plaie par rayure. Sélectionnez Image, puis tapez 8 bits pour modifier l’image à partir de RVB 24 bits. Sélectionnez Plugins, Macros, Installer Wound_healing_size plugin pour installer le plugin Wound Healing Size.
Après cela, définissez le rayon de la fenêtre de variance sur 20, la valeur seuil sur 100, le pourcentage de pixels saturés sur 0,001. Oui pour Set Scale global, puis cliquez sur OK. Vérifiez que la zone définie est la zone de la plaie et répétez l’opération pour d’autres égratignures. Enfin, calculez le pourcentage de cicatrisation de la zone de rayure des cellules migrantes ou proliférantes sur 24 heures à l’aide de l’équation affichée à l’écran.
Ici, T0 est la zone au temps zéro heure, et TC est la zone à zéro heure, quatre heures, 12 heures ou 24 heures. La génération d’entéroïdes et la procédure de cicatrisation des plaies monocouche dérivée d’entéroïdes sont montrées dans ces images. Une culture d’entéroïdes intestinaux tridimensionnels non humains de primates est utilisée pour se dissocier en monocouches bidimensionnelles.
Les monocouches ont été cultivées à plus de 90% de confluence dans une plaque de 24 puits, puis traitées avec HA35 ou PBS pendant 24 heures. Les monocouches ont ensuite été rayées avec une pointe de pipette P200. Voici les images représentatives de HA35 dans les traitements de contrôle des monocouches entéroïdes de primates non humains.
Les images ont été obtenues à zéro heure, quatre heures, 12 heures et 24 heures après avoir effectué une rayure avec une pointe de pipette P200. L’effet de HA35 sur les monocouches andoïdes cicatrisantes est montré ici. Le changement dans la cicatrisation des plaies au fil du temps dans les monocouches entéroïdes dépend de la concentration du traitement HA35.
HA35 a significativement augmenté la cicatrisation des plaies après quatre heures et 12 heures à 100 microgrammes par millilitre et 200 microgrammes par millilitre par rapport au contrôle, mais les taux de guérison ont convergé entre les traitements de 24 heures. L’une des choses les plus importantes à retenir avec cette procédure est que les monocouches entéroïdes intestinales sont de courte durée. Ainsi, une fois qu’ils sont à 90% confluides, les enquêteurs devraient chercher à les utiliser rapidement.
Cette technique est devenue notre modèle de prédilection pour la régénération intestinale prématurée in vitro, surtout si nous sommes intéressés par des lésions plus mécaniques qu’inflammatoires.
