Ce protocole est important car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier l’inflammation cornéenne et sa contribution à la cicatrisation des plaies dans des conditions normales et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée une plaie épithéliale précise et reproductible sans percer la membrane basale. Ce modèle de blessure cornéenne est simple et rapide à réaliser.
La démonstration de la procédure sera faite par le prince Akowuah, un doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de fluorescéine à 1% en dissolvant 10 milligrammes de sel de fluorescéine de sodium dans un millilitre de solution saline stérile ou PBS. Ensuite, pour l’anesthésie, préparez 10 millilitres d’un cocktail kétamine-xylazine en mélangeant deux millilitres de kétamine, un millilitre de xylazine et sept millilitres de PBS stérile.
Après avoir anesthésié une souris C57 noire 6 de type sauvage âgée de 8 à 12 semaines, évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant le réflexe de pédale après le pincement des orteils. Pour créer la plaie cornéenne épithéliale, placez la souris anesthésiée sous un microscope à dissection. Ne blessez que l’œil droit ou gauche et maintenez la cohérence avec l’œil blessé lors du passage de la souris à la souris.
Gardez l’œil grand ouvert en tenant les paupières avec le pouce et l’index. Ensuite, à l’aide d’une tréphine stérile de deux millimètres de diamètre, délimitez le centre de la cornée et faites doucement virevolter la tréphine pour faire une impression sur l’épithélium cornéen. N’appliquez pas de pression excessive, car cela pourrait entraîner une perforation de la cornée.
Ensuite, en tenant le spud stérile du club de golf émoussé à un angle d’environ 45 degrés par rapport à la surface de la cornée, débrider l’épithélium en grattant soigneusement et continuellement dans la zone délimitée à l’aide du spud. N’appliquez pas de force excessive et maintenez l’hydratation en utilisant du PBS stérile si nécessaire. Pour surveiller la fermeture et la réépithélisation des plaies, pipettez 1 à 1,5 microlitre de solution de fluorescéine à 1 % sur la surface blessée et imagez la cornée à l’aide d’un microscope numérique avec une source de lumière bleue.
Imaginez la cornée blessée à des moments précis après la blessure. Prenez des images dans la première minute de l’ajout de la solution de fluorescéine pour éviter la propagation de la solution à l’épithélium environnant, ce qui peut entraîner une surestimation de la taille de la plaie. Ensuite, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, tracez la zone de la plaie et exprimez la zone de la plaie à chaque point temporel en pourcentage de la zone de la plaie d’origine à zéro heure.
Une micrographie électronique à transmission de la plaie cornéenne démontre que la membrane basale de l’épithélium reste intacte même après la blessure. Chez les souris de type sauvage âgées de 8 à 12 semaines, la fermeture de la plaie est complète 24 heures après la blessure. La réponse inflammatoire à la plaie est caractérisée par l’imagerie cellulaire au niveau du limbe.
On voit ici le vascularisme limbique d’une cornée non enroulée avec des neutrophiles extra-vasculaires, et celui d’une cornée blessée avec des plaquettes extravasculaires et des neutrophiles 30 heures après l’abrasion. Pour reproduire avec succès ce protocole, la même souche dans chaque gamme de souris doit être utilisée, et la taille et la profondeur de la plaie doivent être créées comme décrit.
