Ce protocole décrit comment concevoir des jonctions neuromusculaires humaines 3D fonctionnelles in vitro qui peuvent être utilisées pour étudier les pathologies neuromusculaires et tester des thérapies potentielles. Cette technique utilise la stimulation optogénétique simultanée et le traitement vidéo. Il s’agit de changements quantifiés dans la fonction de la jonction neuromusculaire au cours du développement et dus à des facteurs externes, tels que les neurotoxines et le sérum des patients atteints de myasthénie grave.
Les étapes impliquant l’ensemencement de la cellule musculaire et du motoneurone dans le bioréacteur peuvent être difficiles au début. Garder le mélange de gel de collagène sur la glace peut aider à prolonger le temps disponible pour ensemencer toutes les cellules avant que le gel ne se solidifie. Commencez par mélanger une base de 10 à 1 à un mélange d’agent de durcissement de polydiméthylsiloxane, ou PDMS, et placez le mélange dans une chambre à vide.
Fermez toutes les vannes et allumez le vide pour dégazer le mélange pendant au moins 30 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Versez le mélange dans des moules et dégazez les moules dans la chambre à vide pendant 1 heure, puis fermez les moules avec la moitié supérieure du moule dans la bonne orientation. Placez une tige d’acier hexagonale sur le centre et serrez les deux côtés.
Ensuite, remplissez le dessus avec PDMS et durcissez les moules dans un four à 65 degrés Celsius pendant au moins 4 heures. Une fois que les moules ont refroidi à la température ambiante, retirez les plates-formes des moules. Pendant ce temps, le couvercle en verre glisse dans 1% de polyol de tensioactif non ionique pendant 30 minutes, en veillant à ce que les feuillets de couverture ne s’empilent pas et soient tous correctement enduits, puis rincez-les bien avec de l’eau distillée et séchez-les pendant la nuit à 65 degrés Celsius.
Traitez les glissements de couvercle en verre et la plate-forme PDMS à l’aide d’un nettoyeur plasma à haute température avec 6 litres par minute d’oxygène pendant 1 à 2 minutes. Une fois traités, collez les deux ensemble en appuyant sur le PDMS sur le bordereau de couverture pendant au moins 30 secondes. Préparez un mélange 4 à 1 de 3 milligrammes par millilitre de collagène 1 et de matrice de membrane basale solubilisée, puis remettez en suspension les myoblastes dans ce mélange de collagène fraîchement préparé.
Ensuite, ajoutez 15 microlitres de cette suspension de collagène cellulaire à chaque chambre musculaire du bioréacteur, en veillant à répartir la suspension sur les deux piliers à l’aide de la pointe de la pipette. Laissez le mélange de gel cellulaire polymériser à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis remplissez bien chaque bioréacteur avec 450 microlitres de milieu de croissance myotonique. Au jour 11 de la différenciation des motoneurones, transférez les cellules et les milieux dans un tube de 50 millilitres et laissez les neurosphères se déposer au fond pendant 5 minutes.
Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 millilitres de milieu de culture en suspension de motoneurone complété par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 10 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales. Au jour 14 des protocoles de différenciation, ensemencez les motoneurones dans la plate-forme. Préparez un mélange de gel 4 à 1 de 2 milligrammes par millilitre de collagène 1 et de matrice de membrane basale solubilisée.
Utilisez une passoire cellulaire de 400 nanomètres pour sélectionner de grandes neurosphères et les remettre en suspension dans le mélange de gel préparé. Aspirer soigneusement les milieux du réservoir et de la neurosphère, puis ajouter 15 microlitres du mélange de gel dans le canal de la neurosphère. Chargez une pipette de 10 microlitres avec 10 microlitres de gel et choisissez une neurosphère.
Déposez la neurosphère dans le canal de la neurosphère, en vous assurant qu’elle est dans la chambre, puis soulevez lentement la pipette tout en libérant le gel restant une fois la neurosphère déposée. Laissez le gel polymériser pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis ajoutez 450 microlitres de NbActiv4 complétés par 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 10 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales aux réservoirs. Pour l’imagerie, utilisez un microscope fluorescent inversé avec un logiciel de caméra à semi-conducteurs à oxyde métallique complémentaire scientifique.
Réglez le Binning sur 2 par 2, l’exposition à 20 millisecondes, l’obturateur roulant allumé, le taux de lecture à 540 mégahertz, la plage dynamique à 12 bits et le gain 1 et le mode capteur à chevauchement. Utilisez un objectif 2x sur le microscope pour imager les microtissus et attacher une chambre à cellules vivantes à l’étage du microscope. Sélectionnez la région d’intérêt qui contient les tissus squelettiques innervés pour minimiser la taille du fichier et le temps de traitement, puis placez un filtre d’émission passe-long de 594 nanomètres entre l’échantillon et l’objectif d’imagerie pour filtrer les impulsions de lumière bleue de la caméra.
Ensuite, placez une plaque rectangulaire à 4 puits contenant quatre bioréacteurs dans la chambre des cellules vivantes, puis cliquez sur la vue en direct et centrez et concentrez l’image avec le retour sur investissement souhaité. Téléchargez le code de macro personnalisé à partir du dossier GitHub pour contrôler la position de la scène, la carte Arduino et l’acquisition vidéo, puis définissez le film de sortie comme groupe de tissus de soulignement de jour nom de tissu de trait de soulignement nom de l’expérience point ND2. Exécutez le code de macro avec les coordonnées X et Y souhaitées définies sur la scène et acquérez un laps de temps rapide avec 1700 images à 50 images par seconde.
Après l’imagerie, remplacez le support et retournez les échantillons à l’incubateur. Prévoyez au moins 24 heures entre les séances d’acquisition d’images pour éviter la fatigue des tissus. Pour le traitement des films, téléchargez les fichiers à partir du dossier GitHub et utilisez le code MATLAB personnalisé pour traiter les vidéos en analyse par lots.
Ouvrez le script d’analyse récursive du système d’exploitation pour avoir toutes les vidéos acquises dans le même dossier. Ajustez les paramètres de pré-analyse et exécutez le script récursifOSAnalysis pour analyser les films via un traitement parallèle. Ajustez les paramètres de post-analyse tels que le temps de référence, le seuil de crête, la proéminence min-min et la largeur min-min selon vos besoins.
Enfin, générez une sortie vidéo et graphique en exécutant recursiveOSMovie pour générer un fichier vidéo pour chaque tissu avec sa trace de contractilité respective. Ce protocole a été testé en utilisant deux systèmes à échelles différentes, un dispositif microfluidique produisant des tissus musculaires squelettiques de 1 millimètre de long comprenant environ 20 000 myoblastes et le système de bioréacteur à puits ouvert résultant en des tissus musculaires de 4 millimètres de long comprenant environ 450 myoblastes. Une configuration optique a été construite pour permettre une stimulation contrôlée des motoneurones avec de la lumière bleue et la fonction NMJ a été élevée à l’aide d’un script macro de microscope personnalisé associé à un code Arduino personnalisé.
Ce code comprend des paramètres réglables réglables et détermine si une contraction est déclenchée en fonction du temps entre une impulsion lumineuse et le début du pic de contractilité. Le système a capturé l’amélioration de la fonction NMJ dans les tissus montrant une augmentation des réponses déclenchées une semaine après la fabrication des tissus, suivie d’une fonction stable pendant une semaine supplémentaire. L’alpha-bungarotoxine a arrêté toutes les contractions déclenchées et spontanées, ce qui a entraîné une perturbation complète de la fonction NMJ, démontrant que la stimulation lumineuse des tissus nécessite un NMJ fonctionnel.
L’analyse des tissus traités avec 20% de sérum de myasthénie grave pendant 48 heures a montré une diminution de la fonction par rapport aux tissus témoins traités avec du sérum provenant de donneurs sains. 48 heures après avoir retiré et lavé le sérum, les NMJ conçus ont montré une récupération de la fonction. Assurez-vous que tous les bioréacteurs sont au four pendant un temps égal afin d’éviter la variabilité de rigidité entre les lots.
Assurez-vous également de vérifier l’ensemencement des motoneurones à l’aide du microscope. À la suite de cette procédure, des métalomiques, des protéomiques et un dépistage CRISPR peuvent être effectués pour recueillir des informations supplémentaires et mieux comprendre les changements mécanistes causés par le sérum malade.
