Les auteurs tiennent à remercier Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) pour son appui technique pour élaborer des bioréacteurs et l&#39;incubateur de bioréacteur.

Une. Décellularisation de la BioVaSc <ol><li> Rincer le système vasculaire du segment jéjunal porcin via un accès artériel canule et la lumière intestinale avec du PBS -. Répétez jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement propre. </li><li> Préparer un réservoir de verre de 200 mm de diamètre avec 4 adaptateurs et de les relier par des tubes de silicium à la pompe péristaltique (Ismatec). L&#39;unité de commande de pression peut être surveillée par l&#39;intermédiaire d&#39;un capteur de pression qui est connecté à un dôme stérile à usage unique (voir Figure 1). </li><li> Remplir les bouteilles de réservoir avec decellularization (DZ) solution et vérifier le système de tubes de bulles d&#39;air. </li><li> Connectez la lumière intestinale avec attaches de câble aux connecteurs de verre pour l&#39;écoulement luminale. La pompe 500 ml solution DZ dans la accès artériel rouge (Figure 1B) du système vasculaire. Interrompre le processus de pompage toutes les 15 minutes à peu appuyer manuellement sur la totalité lumière intestinale. </li><li> Au cours de la decellularizatile processus, la pression de la solution tampon doit être comprise entre 80 - 100 mm Hg, le modèle de la pression artérielle naturelle. </li><li> Laver le BioVaSc avec du PBS - jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit exempt de restes de cellules (&quot;tout blanc&quot;). </li><li> Remplissez le BioVaSc complètement avec une solution DZ et incuber il plonger dans une solution DZ pendant une nuit à 4 ° C sur agitateur à bascule. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.6. </li><li> Placer la solution dans BioVaSc de DNase et incuber pendant une nuit à 4 ° C sur agitateur basculant. </li><li> Retirer la solution de DNase et rincer avec du tampon de lavage. </li><li> γ-stérilisation avec 25 kGy </li></ol> 2. Les différents types de cellules 2.1 Isolement de cellules primaires humaines cutanée microvasculaire endothéliales (mvECs) et des fibroblastes <ol><li> Couper biopsie de peau (de préférence de prépuce) en bandes de 2 à 3 mm de largeur avec un scalpel et rincez-les 3x avec du PBS - solution. </li><li> Couvrir le tissu avec une solution Dispase et incuber pendant 16 à 18 heures à 4 ° C. </li><li> Épiderme Séparez derme avec 2 pinces et transférer à la fois séparément dans des boîtes de Pétri remplies avec du PBS +. </li><li> Rincer derme bandes 1x avec Versene. </li><li> Ajouter 10 ml de trypsine / EDTA en solution aux bandes de derme et incuber dans l&#39;incubateur pendant 40 min. </li><li> Arrêter la réaction enzymatique immédiatement avec 1% de FCS. </li><li> Transférer des bandes de peau à une boîte de Pétri remplie de VascuLife et gratter chaque bande avec le scalpel 8x chaque côté, en ajoutant un peu de pression. </li><li> Transférer la suspension cellulaire produite par l&#39;intermédiaire d&#39;un tamis cellulaire à un tube de centrifugation et rinçage 3 fois de tamis cellulaire avec VascuLife. </li><li> Centrifuger le tube à 1 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire avec VascuLife. </li><li> Pour isoler les fibroblastes, le derme chop bandes en petits morceaux à l&#39;aide du scalpel. </li><li> Ajouter 10 ml de solution de collagénase à des morceaux de derme. </li><li> Incuber pendant 45 minutes dans l&#39;incubateur, puis centrifuger et retirez soigneusement supernatant. </li><li> Laver 1x à granulés avec du DMEM + 10% FCS +% Penstrep, centrifugeuse et retirez soigneusement le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans du milieu de culture et les transférer dans un flacon de culture T75 pour permettre aux cellules de croître sur le tissu. </li></ol> 2.2 Tumor Cell Line S462 La lignée cellulaire tumorale S462 (aimablement fourni par le Dr Nikola Holtkamp, ​​Université Charité de médecine de Berlin) a été généré à partir d&#39;une tumeur maligne des nerfs périphériques gaine tumeur d&#39;une patiente à l&#39;héréditaire de type syndrome de prédisposition tumorale de neurofibromatose de type 1 9. S462 sont cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10% de FCS. Moyen doit être changé tous les 2 - 3 jours. Une fois par semaine, les cellules doivent être répartis. 3. Système de test de la tumeur: statiques Conditions Culture rapport à la culture dynamiques des systèmes de bioréacteur <ol><li> Couper le Muc-SIS tubulaire ouverte d&#39;un côté et de le fixer entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules, 10 mm de diamètre, l&#39;auto constructed). Couvrir le Muc-SIS dans un milieu de culture cellulaire pendant la nuit. </li><li> cellules de semences isolé du nombre de cellules définies (voir ci-dessous) sur un ou deux côtés de la SIS (mono-ou co-culture mis en place). <ol><li> Seed 8000 cellules / cm 2 de mvECs primaires dans un volume total de 100 pi sur la surface basolatérale de la SIS (ex-séreuse). Remplir 3 h plus tard, le bien avec le milieu à assurer une culture immergée. </li><li> Laisser les cellules endotheliales à adhérer pendant 3 jours. Retournez le système de culture statique de 180 ° et le transférer sur une plaque de 12 puits. </li><li> Ensemencer un mélange de fibroblastes dermiques primaires (8000 cellules / cm 2) et de cellules tumorales (15 000 cellules / cm 2) dans un volume total de 500 pi sur la surface apicale de la SIS (du côté de l&#39;ancienne lumen). </li><li> Laisser les cellules adhèrent pendant 3 heures et remplissage de la cuve avec un milieu (culture immergée, moyenne: 50% Vasculife + 50% DMEM supplémenté avec 10% de FCS). </li><li> Le système de test de la tumeur est cultivée dans des conditions statiques unT 37 ° C, 5% CO 2 dans l&#39;incubateur pendant 14 jours supplémentaires. Changer le milieu de culture tous les 2 - 3 jours. </li></ol></li><li> Pour la culture dynamique, fixer le SIS-Muc entre deux anneaux métalliques et semences mvECs primaires comme décrit au point 3.2.1. Après 3 jours supprimer le SIS-Muc des anneaux métalliques et insérer la membrane dans le réacteur à écoulement (voir les figures 2C et 2D). Appliquer le primaire fibroblastes dermiques et les cellules tumorales avec une seringue et une canule sur la matrice dans le bioréacteur, et de permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant 3 heures avant de remplir le système de bioréacteur avec un milieu de culture. </li><li> Sur les conditions de culture jour dynamiques suivants avec un débit constant milieu (3,8 ml / min, 37 ° C et 5% CO 2) peut être initié. La culture dynamique est maintenue pendant 14 jours, le milieu de culture est changé au bout de 7 jours. </li><li> L&#39;installation d&#39;essai dynamique est cultivé dans un incubateur d&#39;auto-construit qui fournit un flux de média à travers une pompe et la température nécessaire et CO 2 </sub&gt; Contenu. </li></ol> 4. Méthodes de caractérisation pour l&#39;analyse 4.1 Fixation et paraffine-encastrement de la matrice de collagène ensemencée <ol><li> Pour (immuno-histologiques) caractérisations éliminer le milieu de culture et fixer le tissu avec du paraformaldéhyde 4% pendant 2 heures. </li><li> Retirer 4% de paraformaldéhyde et de transférer le SIS de l&#39;insert métallique à une cassette de tissus enrobage. Arrosez le tissu pour enlever restant fixateur et déshydrater pour l&#39;infiltration de paraffine. </li><li> Avant l&#39;intégration dans un bloc de paraffine, couper le SIS à 2 - 3 tranches et les placer dans un moule en métal de base de paraffine rempli de sorte que les surfaces de coupe orientés vers le bas. Ajouter la cassette de tissus sur le dessus du moule en tant que support. </li><li> Couper des tranches de 5 um et flotter dans un bain à 40 ° C de l&#39;eau pour le dressage, puis monter les diapositives sur des lames de verre appropriés. Diapositives non enrobés, sont utilisés pour H &amp; E taches, des lames de polylysine revêtu pour la coloration immunohistochimique pour améliorer la fixation.Laissez sécher complètement les tranches. </li><li> Faire fondre la paraffine, retirez-le avec du xylène et réhydrater tranches pour après coloration. </li></ol> 4.2 Coloration <ol><li> Les tranches réhydratés peuvent être colorées à l&#39;hématoxyline / éosine un aperçu coloration normalisée. </li><li> Pour la coloration immunhistological, fixes et des tranches de tissu paraffine infiltré doivent subir une récupération d&#39;antigène pour permettre anticorps reconnaissent et se lient à leurs épitopes spécifiques. Par conséquent, déparaffinées et réhydratées diapositives sont placées dans un cuiseur à vapeur chauffée avec du tampon au citrate (pH 6,0) pendant 20 min. </li><li> diapositives de transfert aux tampon de lavage (0,5 M tampon TBS + 0,5% de Tween) et les tranches de cercle avec un stylo de PAP pour minimiser le volume nécessaire pour des solutions de coloration. </li><li> Placer la lame dans une chambre à humidité. Pour garantir une visualisation de raifort spécifique de la peroxydase à médiation par des antigène-anticorps se liant, la peroxydase endogène doit être saturée avec 3% de peroxyde d&#39;hydrogène. </li><li> Antib primaireody dilutions sont appliquées sur les tranches, incubées pendant 1 heure à température ambiante et soigneusement lavés avec du tampon de lavage. </li><li> Pour la détection des liaisons antigène-anticorps spécifiques de l&#39;Ultra Vision Quanto Système de détection de HRP DAB (Thermo Scientific) est utilisé selon le protocole recommandé. </li><li> Les noyaux sont contre-colorées avec l&#39;hématoxyline pendant 1 min. </li><li> Les lames sont montées avec un milieu aqueux, on les sèche, et imagés en utilisant un microscope inversé. </li></ol>

<ol>
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Rev. 63, 195-196 (2011).</li><li>Pusch, J., Votteler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+performance+of+a+three-dimensional+model+that+mimics+the+microenvironment+of+the+small+intestine.">The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine.</a> Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).</li><li>Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularised+human+tissue+models:+a+new+approach+for+the+refinement+of+biomedical+research.">Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research.</a> J. 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Les auteurs ont rien à révéler.

<html> Lorsque l&#39;on compare 2D et 3D des systèmes de culture dans la recherche de la tumeur, les systèmes 3D, en dépit d&#39;être l&#39;approche la plus coûteuse, se sont avérés mieux reproduire les conditions de micro-environnements biologiques. On a pu montrer que certaines cellules tumorales se développent beaucoup plus lentement dans une culture en 3D par rapport à une culture 2D commun 12, qui est conforme à la situation dans un véritable tumeur. Bissell et collaborateurs ont montré dans leur travail que le comportement des cellules cancérigènes du sein correspond à la situation in vivo, y compris la morphologie cellulaire et de signalisation, et plus précisément quand une culture en 3D au sein d&#39;une matrice propose des interactions cellule-ECM. En outre, ils ont souligné l&#39;importance de l&#39;environnement extracellulaire en 3D en démontrant que les changements dans les interactions environnementales ont conduit à la réversion des cellules malignes à un phénotype normal. En outre et surtout, ces résultats peuvent également être confirmées dans des modèles animaux in vivo 10,11. ontenu &quot;&gt; La comparaison directe des expériences in vivo sur les animaux et dans les modèles de tissus in vitro révèle des avantages et des inconvénients dans les deux systèmes. L&#39;un des avantages des modèles in vitro est la permission d&#39;un temps réel beaucoup mieux ou imagerie fixe par microscopie. Une limitation est que ils imitent conditions statiques ou à court terme, alors que les systèmes in vivo progressent souvent. L&#39;absence actuelle de système vasculaire et le transport normal de petites molécules, accueillir les réponses immunitaires, et d&#39;autres interactions cellulaires sont d&#39;autres inconvénients des modèles in vitro 12. Par conséquent, 3D dans des systèmes in vitro tel que présenté dans cette étude offrent des perspectives prometteuses à l&#39;expérimentation animale. Ils offrent une meilleure comparabilité de l&#39;organisme humain et donc de minimiser les erreurs d&#39;interprétation expérimentales. biomimétique dans des systèmes modèles in vivo sera donc devenir plus pertinent d&#39;étudier la façon dont le cancer et les métastases dépendent sur les conditions micro-environnementales qui régissent tumorigenesis 11. Notre étude montre que l&#39;environnement 3D fournie par le SIS-Muc conduit à une formation de tumeur plus semblable à un tissu de cellules, qui n&#39;est pas observée dans la culture de cellule commun 2D (voir la figure 3A). En outre, l&#39;utilisation de cellules primaires dérivées de biopsies de tumeurs est une étape très importante vers une médecine personnalisée, une discipline qui vise à identifier le meilleur traitement en fonction des besoins individuels du patient. Incorporant des cellules tumorales spécifiques au patient primaires isolées à partir de matériel de biopsie permettra de tests in vitro des stratégies thérapeutiques. Ces systèmes de test, il sera possible d&#39;étudier les différentes drogues et leurs combinaisons en un temps et criblage à haut débit de réduction des coûts. En outre, l&#39;intégration de cellules stromales associées à la tumeur comme le montre cette étude est importante pour l&#39;approche personnalisée, puisque la progression des influences microenvironnement de la tumeur de la tumeur 13 et pourrait se révéler comme Conviecible thérapeutique le. En variante à une approche personnalisée, notre modèle de tumeur peut être modifié pour servir de système de test de la tumeur généralisée par l&#39;incorporation des lignées cellulaires tumorigènes établies. Il s&#39;agit d&#39;une adaptation prometteuse à des fins de recherche fondamentale. À la fois pour le dépistage de drogues se rapproche de la présence d&#39;une structure vasculaire est nécessaire de tester la répartition et l&#39;absorption de substances thérapeutiques. La matrice de SIS-Muc permet l&#39;ensemencement avec basolatérale primaire MVEC pour les études d&#39;absorption de la barrière, le réensemencement des structures vasculaires préservés de la BioVaSc permettra d&#39;améliorer encore l&#39;étude de l&#39;administration de médicaments. Afin de créer des modèles de tissu, une matrice biodégradable 3D peut être utilisé en tant que cadre pour une co-culture de différents types de cellules 14. L&#39;utilisation de telles matrices 3D est souvent limitée par l&#39;absence de vascularisation fonctionnelle. Ce problème peut être résolu par l&#39;utilisation de la BioVaSc, qui offre str conservé de vaisseau sanguinuctures, qui peuvent être ensemencés avec des cellules endotheliales. En outre, la BioVaSc fournit des composants extracellulaires, qui assurent l&#39;adhérence des cellules et de faciliter la différenciation des tissus. Il permet également la fonction spécifique des tissus de longue date de tissus 3D bioartificiel 7,8,15. La condition préalable pour l&#39;ingénierie de substituts vasculaires fonctionnelles est l&#39;imitation de physiologique humain et les conditions biomécaniques. Par conséquent, les systèmes de bioréacteurs, qui peut mettre en œuvre ces exigences in vitro, sont d&#39;un intérêt extrême pour la création de modèles de tumeurs biologiques. La combinaison de la BioVaSc, la technologie de bioréacteur et de la co-culture de différents types de cellules est un procédé très prometteur pour produire des tissus de tumeurs vascularisées, ce qui permettra l&#39;étude des mécanismes pertinents pour la progression du cancer tels que l&#39;angiogenèse et la métastase. Nous voyons ces modèles tumoraux comme une approche prometteuse pour compléter les études animales en fournissant un équivalentà la physiologie de la tumeur humaine.

Nouveaux produits pharmaceutiques doivent être validés en ce qui concerne leur qualité, la sécurité et l&#39;efficacité avant l&#39;autorisation de commercialisation. À ce jour, l&#39;expérimentation animale sont la méthode standard pour le dépistage des drogues et de validation. Toutefois, en raison des différences spécifiques à l&#39;espèce, l&#39;expérimentation animale, souvent, ne permettent pas d&#39;évaluer complètement l&#39;effet des composés chez l&#39;homme 1. Pour cette raison, il est important de générer des modèles de tissu humain qui peuvent être utilisés pour des tests in vitro de nouveaux médicaments et de substances. L&#39;un des axes de notre groupe est la création de modèles in vitro d&#39;essai dans notre échafaudage avec vascularisé biologique (BioVaSc) 2,3. Le BioVaSc peut être utilisé comme un système de matrice 3D statique ou dynamique. Pour la culture statique, le segment de jéjunum de porc décellularisé (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS) est placé dans un insert métallique pour le réensemencement des cellules. Diverses cellules, telles que le cancer et les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur l&#39;échafaudage. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pour la culture dynamique, la BioVaSc est attaché à un système de bioréacteur que s&#39;applique l&#39;écoulement dans tout le système vasculaire ou à travers la surface de l&#39;échafaudage. Bioréacteurs actuels mettent en œuvre des stimuli biologiques, mécaniques, ou électriques qui agissent sur ​​la différenciation ou de la prolifération des cellules 4. Pour bioréacteurs dans le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire, le concept de base est de simuler les conditions dans le corps humain. Dans lequel, les cellules sont fournies un milieu naturel dans lequel ils peuvent interagir les uns avec les autres et leur matrice extracellulaire environnant. Pour la production de systèmes in vitro ou transplantations de test dans, la capacité d&#39;imiter l&#39;environnement naturel des cellules avec une structure de support appropriée et le système de bioréacteur est essentiel 5. Par conséquent, des dispositifs plus complexes et techniquement exigeants doivent être développées afin de s&#39;acquitter de ces tâches 6. Il est en outre possible d&#39;utiliser notre échafaudage pour l&#39;établinfligés aux vascularisé un modèle en raison des structures tubulaires, qui comprennent conservés l&#39;artère d&#39;alimentation, de la veine, et le lit capillaire de liaison. Toutes les cellules porcines ont besoin d&#39;être enlevé par décellularisation chimique, mécanique et enzymatique, et l&#39;échafaudage gamma-stérilisé. Les structures tubulaires vasculaires peuvent ensuite être restaurées réensemencées avec des cellules endotheliales microvasculaires humaines en utilisant un bioréacteur à perfusion recirculation 7, qui imite les paramètres biomécaniques et / ou biochimiques, tels que le pH, la température, la pression, l&#39;alimentation en substances nutritives et l&#39;enlèvement des déchets 6. La ré-endothélialisation des structures tubulaires crée un équivalent humain d&#39;un vaisseau sanguin à l&#39;intérieur de l&#39;échafaudage de collagène 3,7. Dans l&#39;étape suivante, la surface des anciens lumière (muqueuse) peut être ensemencée avec des cellules humaines primaires d&#39;établir des co-cultures 3,7,8. Dans cette étude, un système de test de la tumeur 3D est mis en place par co-culture d&#39;une lignée de cellules de tumeur primaire avec stcellules Romal dans des conditions statiques et dynamiques sur le SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

Le cancer est l&#39;une des principales causes de décès dans le monde. Les stratégies thérapeutiques actuelles sont principalement développées dans les systèmes de culture en 2D, qui reflètent mal les conditions physiologiques in vivo. Matrices 3D biologiques fournissent les cellules d&#39;un environnement dans lequel les cellules peuvent s&#39;auto-organiser, permettant l&#39;étude de l&#39;organisation des tissus et la différenciation cellulaire. Ces échafaudages peuvent être ensemencées avec un mélange de différents types de cellules pour étudier cellule-cellule 3D-interactions directes. Pour imiter la complexité 3D de tumeurs cancéreuses, notre groupe a mis au point un système 3D in vitro d&#39;une tumeur de test. Nos modèles de systèmes de test de tissu 3D la situation in vivo de tumeurs malignes nerveux périphériques de la gaine (de MPNST), que nous avons établies avec nos décellularisée secteur du jéjunum de porc d&#39;échafaudage vascularisé biologique dérivé (BioVaSc). Dans notre modèle, nous réensemencer une matrice BioVaSc modifié avec des fibroblastes primaires, des cellules endothéliales microvasculaires (mvECs) et la lignée cellulaire de tumeur S462. Pour la culture statique, la structure vasculaire du BioVaSc est retiré et l&#39;échafaudage est découpé restant ouvert d&#39;un côté (petite sous-muqueuse intestinale Muc-SIS). La matrice résultante est ensuite fixé entre les deux anneaux métalliques (couronnes de cellules). Une autre option est de culture de la cellule tête de série, Muc-SIS dans un système de bioréacteur d&#39;écoulement qui expose les cellules à des contraintes de cisaillement. Ici, le bioréacteur est raccordé à une pompe péristaltique dans un incubateur à auto-construit. Un ordinateur régule l&#39;oxygène artériel et la fourniture des nutriments par l&#39;intermédiaire des paramètres tels que la pression artérielle, la température et le débit. Cette configuration permet une culture dynamique soit pulsatile de la pression régulée ou débit constant. Dans cette étude, nous avons pu établir avec succès à la fois un système de culture 3D statique et dynamique pour MPNST. La capacité à modéliser les tumeurs cancéreuses dans un environnement 3D plus naturel permettra à la découverte, le test et la validation deproduits pharmaceutiques à venir dans un modèle humain-comme.

Comme le montre la figure 1B, nous décellularisé le segment jéjunal porc (environ 2 m de longueur et 20 mm de diamètre) avec des structures tubulaires préservés du réseau capillaire. Après chimique, enzymatique et mécanique décellularisation, on a obtenu un échafaudage de collagène I / III, qui peut être utilisé pour la culture cellulaire 3D. Un test de Feulgen a été effectuée pour démontrer la pureté (absence de restes d&#39;ADN) de la matrice (données non présentées). Les figures 2A et 2B montrent la culture statique de SIS-Muc fixé par les couronnes de cellules. Nous avons fixé le SIS-Muc dans un bioréacteur conçu en interne (figure 2C) pour la culture dynamique. Figure 2D illustre le flux dynamique simulée à travers la chambre du bioréacteur. Le bioréacteur est placé dans un système d&#39;incubateur pour elle-même et relié à une pompe péristaltique. Cette configuration permet une culture dynamique soit avec flux pulsatile ou c pression régulée<html> flux onstant. La figure 3 donne une vue d&#39;ensemble de la ligne de façon statique en culture d&#39;une tumeur S462 cellulaire en 2D monoculture (figure 3A) et en 3D coculture (figures 3B-3D). Figure 3B représente le triple de la culture de cellules tumorales S462 et les fibroblastes primaires sur le côté apical de SIS -Muc (ancien côté lumière intérieure) et MVEC sur le côté basolatéral (ancien côté séreuse). L&#39;identification de différents types de cellules est possible par coloration des marqueurs spécifiques du type cellulaire, telles que le facteur de von Willebrand à étiqueter MVEC (Figure 3C). Les cellules S462 p53-positives peuvent être distinguées des fibroblastes primaires en p53 négatif (Figure 3D) et de la distribution 3D de cellules peut être analysée. L&#39;équivalent de la figure 4 montre à la figure 3 de la culture cultivée triple dynamiquement. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Decellularization set-up. (A) bioréacteur et pompe set-up pour la décellulariser BioVaSc, contrôlé par un PC. (B) décellularisée BioVaSc dans le réservoir de verre. Le lumen et l&#39;entrée artérielle sont reliés aux adaptateurs. . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figure 2. Plus de vue de la culture différents set-ups. (A) Vue en coupe de CAO d&#39;un système de culture statique à plaque à puits de microtitration, (B) des inserts métalliques pour la culture statique, la simulation d&#39;écoulement de fluide (C) (de champ de vitesse [m / s]) pour la culture dynamique de la paupière supérieure du bioréacteur d&#39;écoulement , (D) bioréacteur d&#39;écoulement de la culture dynamique relié à la pompe péristaltique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> ent &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figure 3. Vue d&#39;ensemble de la caractérisation immunohistochimique du modèle de tumeur 3D statique. (A) d&#39;hématoxyline tache de la statique de culture culture 2D mono de cellules S462 sur une lame Permanox, (B) coloration H &amp; E de la culture triple 3D statiquement en culture, flèches indiquent les cellules endothéliales, (C) la coloration immunohistochimique pour le facteur de von Willebrand, (D ) coloration immunohistochimique pour p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir chiffre</a> <img alt="Figure 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figure 4. Vue d&#39;ensemble de la caractérisation immunohistochimique du modèle de tumeur 3D dynamique. (A) H &amp; E tache de la culture triple 3D dynamique de culture, flèches indiquent les cellules endothéliales, (B) coloration immunohistochimique pour le facteur de von Willebrand, (C) coloration immunohistochimique pour p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a>

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d&#39;essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d&#39;une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d&#39;écoulement.

génie tissulaire d&#39;un être humain 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Système de tumeur de test

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.2K vues.  University Hospital Würzburg.  Méthodes pour créer des tissus tumoraux humains 3D comme systèmes d'essai sont décrits. Ces technologies sont basées sur un échafaudage décellularisé biologique vascularisé (BioVaSc), les cellules primaires humaines et d'une lignée cellulaire tumorale, qui peut être cultivée dans des conditions statiques ainsi que dans des conditions dynamiques dans un bioréacteur d'écoulement. 

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Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingénierie tissulaire: Construction d&#39;un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingénierie tissulaire de la tumeur stromale Microenvironnement avec application de Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Production, la caractérisation et utilisations potentielles d&#39;un humain de l&#39;oesophage muqueux modèle 3D de l&#39;ingénierie tissulaire

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Forcer le système V-coude Vertical : une évaluation 3D In Vitro des arcs rectangulaire élastiques et rigides

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...