Ce protocole est significatif parce qu’il permet une analyse in vitro de l’essaim de neutrophiles, qui surmonte de nombreuses limitations de notre incapacité actuelle à expérimenter. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un accès facile aux cytokines sécrètes et aux médiateurs lipidiques que les neutrophiles libèrent pendant l’essaimage et permet une analyse quantitative de l’imagerie. Alors que nous avons appliqué cette technique aux neutrophiles, elle pourrait être étendue pour analyser la migration d’autres globules blancs comme les monocytes et les lymphocytes T.
Commencez par préparer une polyélectrolite cationique de 1,6 milligramme par millilitre, ou solution CP, en ajoutant la quantité appropriée de poudre de CP à l’eau et en la mélangeant sur la plaque de remue-mêle pendant la nuit ou jusqu’à ce que tous les solides soient dissous. Si vous le souhaitez, la solution peut être rendue fluorescente en ajoutant de la poly-L-lysine étiquetée avec fitc. Générez la plaquette de silicium principale à l’aide de procédures de photolithographie standard.
La conception utilisée ici est un tableau rectangulaire de quatre par quatre millilitres de 30 cercles remplis de diamètre micromètre, avec un centre de 150 micromètres à l’espacement central, mais il peut être modifié comme souhaité pour différentes applications. Spin-coat une couche de 40 micromètres d’épaisseur de photorésist négatif sur une gaufrette de silicium. Cuire ensuite la gaufrette à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Et 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Exposez la gaufrette à la lumière UV à travers un photomask chromé de 150 à 160 millijoules par centimètre carré. Cuire la gaufrette à nouveau à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes et 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Puis submergez-le dans le développeur photorésiste pendant 10 minutes. Et rincez-le avec de l’alcool isopropyle. Le motif doit maintenant être visible sur la gaufrette.
Ensuite, bien mélanger un rapport de 10 pour un de polydimethylsiloxane, ou PDMS, prépolymer et son agent curatif. Et verser le mélange non séché sur la gaufrette principale dans une boîte de Pétri. Traiter sous vide le mélange PDMS non durci jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
Puis curez-le pendant la nuit à 65 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez un scalpel pour couper autour de l’extérieur de la section à motifs de la gaufrette. Et retirez lentement la dalle PDMS durcie, en la plaçant sur une planche à découper propre avec le côté modelé orienté vers le haut.
Perforez les timbres individuels de la dalle PDMS avec un poinçon de biopsie de huit millimètres et placez chaque timbre face vers le bas sur le ruban adhésif pour enlever les débris. Avec ces timbres orientés vers le haut, amorcez chaque timbre avec 100 microlitres de la solution CP pré-préparée, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme entre la solution et le timbre. Ensuite, inversez les timbres sur une couche de solution CP et retirez-les au bout d’une heure.
Tamponnez chaque tampon humide face vers le bas sur une glissière en verre propre six à huit fois pour enlever l’excès de liquide. Ensuite, passer l’aspirateur traiter les timbres pendant une à deux minutes. Adhérez à un espaceur d’imagerie de huit puits de huit millimètres de diamètre au-dessus d’une glissière en verre propre comme guide pour le placement des timbres.
Placez un timbre face contre terre sur la glissière de verre au centre de chaque puits de l’espaceur d’imagerie. Placez ensuite un poids équilibré de 5,6 grammes sur chaque timbre et prévoyez 10 minutes pour l’estampage. Retirez les poids et les timbres de la lame et laissez sécher la couche CP à température ambiante pendant 24 heures avant d’ajouter des bioparticules.
Si le CP est étiqueté avec le FITC, vérifiez l’efficacité de l’estampage à l’aide d’un microscope fluorescent. Coupez une dalle PDMS vierge de la taille de l’espaceur d’imagerie et utilisez le poinçon de biopsie de huit millimètres pour créer des puits dans le PDMS qui s’alignent avec les puits de l’espaceur. Ensuite, adhérez à la dalle PDMS à la glissière en verre.
Décongeler une solution de bioparticules et la diluer à 500 microgrammes par millilitre dans l’eau pour injection. Ajouter 100 microlitres de solution de bioparticules à chaque puits PDMS sur la glissière de verre et faire basculer la glissière pendant 30 minutes. Rincez soigneusement les puits à l’eau et vérifiez le motif sur la lame à l’aide d’un microscope fluorescent.
Le microrése de bioparticules peut être stocké dans un environnement exempt de poussière à quatre degrés Celsius pendant une période d’une période d’au moins trois mois. Préparez les cellules en les réutilisant à 7,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans IMDM avec 0,4% albumen sérique humain. Ajouter 100 microlitres de la suspension à un puits PDMS contenant le microrésexe bioparticule, en s’assurant que la suspension cellulaire est convexe sur le dessus du puits PDMS et ne contient pas de bulles.
Sceller le puits avec un glissement de couvercle de 12 millimètres de diamètre et appuyer doucement avec des pinces à épiler afin que l’excès de suspension cellulaire s’échappe au bord du puits, puis utiliser un tissu pour enlever l’excès. Pour imager les cellules, chargez le réseau de microparticules avec des cellules sur la station d’imagerie cellulaire vivante d’un microscope équipé d’un incubateur de cage réglé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 90% d’humidité relative. Utilisez la microscopie en accéléré, fluorescente et lumineuse pour enregistrer des images à 10 X grossissement toutes les 10 secondes à 405 nanomètres, 594 nanomètres et champ lumineux.
Incuber les neutrophiles dans les puits avec des bioparticules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois heures, en prélevant des échantillons aux points de temps désirés. Utilisez un microscope à champ lumineux pour vérifier que des essaims se forment sur le microrése. Recueillir l’ensemble du volume de supernatant d’un seul puits, et le charger dans un tube de filtre centrifugeuse de 0,45 micromètre, en s’assurant d’analyser chaque point de temps en triplicate.
Centrifugez les tubes à 190 fois G et 20 degrés Celsius pendant cinq minutes, et recueillez le volume filtré. Rangez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment du traitement. Lorsque vous essayez ce protocole, travailler avec photorésiste et développeur dans le capot de fumée.
Mettre en place un protocole approuvé par la CISR avant de préséorber le sang des donneurs humains. Rappelez-vous que les matériaux dérivés du sang humain sont BSL2. Lorsque des neutrophiles sont ajoutés au microréseau bioparticule, les neutrophiles qui contactent les grappes de bioparticules s’activent et déclenchent la réponse grouillante.
Le microréseau de bioparticules a été validé à l’aide d’une microscopie fluorescente en accéléré pour suivre les migrations de neutrophiles vers les grappes de bioparticules. Des essaims stables de neutrophiles se forment autour de chaque amas après 30 à 60 minutes d’exposition. En revanche, les neutrophiles ne montrent pas de migration collective en l’absence de grappes de bioparticules.
L’intensité de fluorescence des noyaux de neutrophile souillés a été utilisée pour déterminer que la taille moyenne de l’essaim autour des grappes de bioparticules était d’environ 1490 micromètres au carré. En l’absence de grappes, la fluorescence d’une région d’intérêt donnée est demeurée constante au fil du temps. Les traces de la migration des neutrophiles montrent que les neutrophiles convergeaient vers un groupe de bioparticules lorsqu’on était présent, mais aucune convergence n’a été observée dans le système de contrôle.
La vitesse des neutrophiles grouillants et non activés a été mesurée, et une différence statistiquement significative dans les distributions de vitesse a été trouvée. La vitesse moyenne des neutrophiles grouillants était de 20,6 micromètres par minute, tandis que la vitesse moyenne pour le contrôle des neutrophiles était de deux micromètres par minute. Les concentrations de 16 protéines que les neutrophiles libèrent pendant l’essaim ont été analysées au fil du temps.
10 protéines ont augmenté en concentration. Deux ont diminué. Et les quatre autres ont augmenté au cours de la première heure d’essaimage, mais ont diminué par la suite.
Tout en effectuant cette procédure, assurez-vous que tout est propre et vos timbres sont séchés correctement, car ceux-ci sont essentiels pour le bon modelage des particules bactériennes. Le développement de cette technique permettra aux chercheurs d’explorer de nouvelles questions dans le domaine de l’essaim de neutrophiles, y compris la façon dont les médiateurs libres et les vésicules extracellulaires sont impliqués dans la communication intercellulaire neutrophile.
