Des témoins de granulés cellulaires positifs et négatifs bien caractérisés avec des niveaux d’expression de protéines ou de transcription définis sont essentiels pour développer des tests immunohistochimiques. Ce protocole décrit un processus de création et de traitement de contrôles de granulés cellulaires fixes et incorporés à la paraffine. De tels contrôles peuvent être utilisés pour caractériser la spécificité de liaison tout en développant un nouveau test d’immunohistochimie.
Les tests IHC sont essentiels à nos efforts de découverte et de développement de biomarqueurs dans tous les domaines thérapeutiques, et le développement de contrôles validés est essentiel pour développer ces tests. Il est essentiel de chauffer le gel à base d’hydroxyéthylagarose à au moins 40 degrés Celsius avant de l’ajouter à la pastille cellulaire. Le gel doit être bien mélangé avec les cellules avant de se solidifier.
Commencez la fixation de la pastille de cellule 293T en ajoutant 30 millilitres de formol tamponné neutre à 10% à une pastille de cellule de trois millilitres pour créer un rapport fixateur / cellule de 10 à un. Remettez les cellules en suspension répétée le tube de 50 millilitres hermétiquement bouché et laissez-les se déposer pendant la nuit à température ambiante. Pour améliorer la fixation, augmentez le rapport surface/volume en inversant le tube le lendemain et en remettant les cellules en suspension.
Après 24 heures de fixation, centrifuger le tube à 930 fois G à cinq degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Assurez-vous que la pastille de cellule est visible et retirez le fixateur en le décantant ou en l’aspirant soigneusement à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Ajouter un gel à base d’hydroxyéthylagarose fondu à 40 à 60 degrés Celsius à la pastille à un rapport gel/granulés cellulaires de un à quatre.
Utilisez une sonde sterling propre de cinq pouces et deux millimètres avec un œil rincé à l’eau du robinet pour remuer doucement le contenu du tube conique de 50 millilitres, créant ainsi une suspension uniforme de cellules fixes dans le gel fondu au fond. Après avoir suspendu uniformément les cellules fixées dans le gel fondu, coiffez le tube chronique et placez-le sur la glace humide pendant cinq à 10 minutes. Une fois que la pastille de gel est solidifiée, placez soigneusement une microspatule propre le long du côté du tube et tirez doucement sur la pastille sans la percer.
Placer la pastille solidifiée sur le papier de biopsie. À l’aide d’une microspatule propre, coupez la pastille de cellule en tranches de quatre à cinq millimètres d’épaisseur pour l’insérer dans une cassette de tissu de 26 millimètres sur 26 millimètres sur cinq millimètres. Placez des tranches individuelles de granulés de gel au centre d’un morceau de papier de biopsie.
Pliez les deux côtés opposés et enveloppez la tranche dans du papier avant de la placer dans une cassette de tissu de 26 par 26 par cinq millimètres. Fermez le couvercle. Placez la cassette de granulés de cellules taillées dans l’autoclave du processeur de tissu rempli de formol tamponné neutre à 10% et exécutez selon un calendrier de traitement court.
Pour intégrer la pastille de cellule, placez les cassettes traitées dans la zone d’attente du centre d’encastrement. Ouvrez le couvercle de la cassette en tissu et dépliez soigneusement le papier de biopsie. Placez la pastille de cellule dans un petit moule d’encastrement jetable de 15 millimètres sur 15 millimètres du côté coupé vers le bas.
Tout en tenant doucement la pastille cellulaire dans le fond du moule avec une pince, ajoutez une infiltration tissulaire de 62 degrés Celsius ou incorporez de la paraffine dans le moule, en recouvrant la pastille de cellule. Déplacez le moule vers un bloc froid pour solidifier la paraffine. Ajustez la pastille de cellule pendant que la paraffine se solidifie et fixez-la dans la position appropriée au fond du moule.
Retirez le couvercle de la cassette. Placez le côté inférieur de la cassette sur le dessus du moule d’incorporation et ajoutez de la paraffine fondue supplémentaire pour couvrir la cassette. Lorsque la paraffine est remplie sur la cassette de tissu, remettez le moule dans le bloc froid pour la solidification.
Ramasser les sections de paraffine préparées à l’aide du microtome rotatif du bain de flottaison sur des lames chargées positivement. Placez la première section en haut de la diapositive à l’intérieur du bordereau de couverture et de la limite de coloration, puis placez les sections suivantes en série les unes sous les autres. Une fois cela fait, séchez d’abord les lames à 23 degrés Celsius pendant 24 heures, puis à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes.
La pastille cellulaire intégrée préparée à l’aide de cette méthode a montré une distribution uniforme des cellules dans toute la section, avec un minimum d’agglutination des cellules et d’interactions dans la pastille. Lorsque l’immunomarquage a été visualisé avec le diaminobenzène brun, le chromogène et trois lignées cellulaires variant les niveaux d’expression du facteur de transcription TEAD ont été observés dans le noyau, allant de nul, à faible, à l’expression forte. L’incorporation des pastilles cellulaires dans un microréseau a permis d’évaluer des témoins avec différents niveaux d’expression dans la même lame sans variation dans les procédures.
Comme le montre cet exemple, un contrôle négatif des cellules souches embryonnaires de souris déficientes en PEG 10 et un contrôle positif des cellules 293T surexprimant le PEG 10 peuvent être observés. S’assurer que les cellules sont fixées de manière adéquate et réparties de manière homogène dans toute la pastille de gel crée un contrôle uniforme et normalisé du dosage. Les pastilles cellulaires peuvent être utilisées comme témoins dans les tests d’immunohistochimie en aval et d’hybridation NC2 avec des méthodes standard de récupération et de marquage des antigènes.
Les contrôles de granulés cellulaires ont permis le développement de nombreux tests immunohistochimiques, en particulier pour les protéines nouvelles ou peu caractérisées. Ils servent de contrôles bien définis qui peuvent aider à caractériser la spécificité des anticorps.
