Nous remercions les sciences naturelles et en génie (CRSNG) et la Société canadienne du cancer pour le soutien financier. CSSC grâce CRSNG et VNL remercie les bourses d&#39;études supérieures de l&#39;Ontario (CGO) du programme de bourses d&#39;études supérieures. ARW remercie la CRC pour une Chaire de recherche du Canada.

Partie 1: fabrication de dispositifs <ol><li> Substrats de verre dans une solution de nettoyage Piranha (3:1 d&#39;acide sulfurique concentré:. Peroxyde d&#39;hydrogène à 30%). Laissez les substrats en solution Piranha pendant 10 min en agitant fréquemment. </li><li> Après un rinçage à l&#39;eau désionisée (DI) de l&#39;eau et le séchage des substrats avec gaz N 2, place les substrats dans la chambre de faisceau d&#39;électrons pour le dépôt de chrome (épaisseur de 250 nm). </li><li> Pour déshydrater les substrat chromées, rincer dans de l&#39;isopropanol et ensuite cuire au four sur une plaque chauffante pendant 5 min à 115 ° C. </li><li> Sécher les substrats et premier avec hexaméthyldisilazane (HMDS) par spin-coating (30 s, 3000 tpm). Spin-coat à nouveau (en utilisant des paramètres identiques) avec Shipley S1811 résine photosensible. </li><li> Pré-cuire le substrat sur une plaque chaude (100 ° C, 2 min), puis modèle de la résine photosensible par exposition aux rayons ultraviolets (UV) pendant 5 s à travers un photomasque. </li><li> Développer les substrats UV exposés à Shipley MF 321 développeur pendant 3 min et laver à l&#39;eau DI. Post-Cuire sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 1 min. </li><li> Etch le chrome exposés en l&#39;immergeant dans le chrome gravure de 30 s. Rincer à l&#39;eau DI, puis plonger dans décapant AZ300T pendant 10 min pour enlever la résine photosensible restante. Rincer à l&#39;eau DI et sécher avec un gaz N 2. </li><li> Dépôt 2-5 um parylène-C (une polymère isolant) par dépôt de vapeur chimique sur un substrat portant motifs de chrome. Dépôt de 50 nm de Téflon AF (pour faire la surface hydrophobe) par spin-coating d&#39;une solution (1% en poids / poids dans Fluorinert FC-40) à 2000 rpm pendant 60 s. Post-Cuire sur une plaque chaude (160 ° C, 10 min). </li><li> Pour former la plaque supérieure, le manteau une. ONU-motifs d&#39;oxyde d&#39;étain-indium (ITO) substrats de verre de 50 nm de Téflon AF, comme ci-dessus </li><li> Post-cuire deux substrats sur une plaque chaude (160 ° C, 10 min). </li></ol> Partie 2: Device Set-up et de l&#39;automatisation <ol><li> En numériques dispositifs microfluidiques exploités dans les &quot;deux-assiette&quot; de configuration, une gouttelettes sont positionnés entre un substrat de fond (avec des électrodes à motifs) et un substrat supérieur (avec une contigus, électrode transparente, généralement formé à partir d&#39;ITO). </li><li> Pour configurer l&#39;appareil en place, enlever les revêtements de polymère de plots de contact d&#39;un substrat de fond en grattant doucement avec un scalpel. Couple de l&#39;exposé des plots du substrat de fond avec 40 broches (figure 1a). </li><li> Power-sur un ordinateur exécutant LabView (National Instruments, Austin, TX), une maison construite boîte de commande (avec un tableau de haute tension relais qui sont commandés par des signaux à partir d&#39;un DAQPad National Instruments), un générateur de fonctions, et d&#39;un amplificateur . La boîte de l&#39;ordinateur / contrôle facilite le contrôle des utilisateurs sur l&#39;application de 100 V RMS / 18 kHz signaux à l&#39;appareil via les connecteurs à 40 broches. </li><li> Monter l&#39;appareil en positionnant deux morceaux de ruban adhésif double face (140 um d&#39;épaisseur au total) sur les bords du substrat en bas et terminer avec des diapositives sans motif ITO (plaque supérieure). </li><li> Pour initialiser le système de contrôle, exécutez le programme d&#39;étalonnage LabView (écrit en interne) pour calibrer l&#39;asservissement. </li><li> Charger l&#39;échantillon et des réactifs dans les réservoirs appropriés (voir section 3, ci-dessous) et les enfermer sous le substrat supérieur (téflon tournée vers le bas). Fixez le connecteur de terre au substrat haut. </li><li> Chargez le code actionnement de LabView (écrit en interne) et exécuter le programme d&#39;initier actionnement des gouttelettes. </li></ol> Partie 3: Préparation des échantillons et de réactifs <ol><li> Préparer tampon de travail (BM): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) et de 0,08% Pluronic F127 w / c. </li><li> Dissoudre la protéine (s) à analyser dans l&#39;échantillon de la BM et la pipette dans le réservoir 1 (R-1) sur l&#39;appareil, comme le montre la figure 1b. </li><li> Préparer précipitant, 20% d&#39;acide trichloracétique (TCA) dans de l&#39;eau DI, et la pipette dans la R-2. </li><li> Préparer le tampon de lavage, 70/30 chloroforme / acétonitrile (ACN) et pipette dans R-4. </li><li> Préparer un tampon resolubilizing, 100 mM bicarbonate d&#39;ammonium (pH 8,0) et 0,08% Pluronic F127 p / v, et la pipette dans la R-5. </li><li> Dissoudre réducteur, tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE), à 10 mM dans la BM et la pipette dans la R-6. </li><li> Dissoudre agent d&#39;alkylation, iodoacétamide (IAM), à 12 mM dans la BM et la pipette dans la R-7. </li><li> Dissoudre la trypsine dans la BM à une concentration égale à 1 / 5 de la concentration de l&#39;échantillon de protéines totales (voir 3.1, ci-dessus) et une pipette en R-8. </li></ol> Partie 4: Exemple de traitement numérique microfluidiques <ol><li> La procédure suivante est automatiquement mis en oeuvre par le biais du code LabVIEW écrite en interne. Le volume des gouttelettes dispensé de réservoirs est défini par les dimensions des électrodes (dans ce cas, les gouttelettes sont dispensés ~ 600nL). </li><li> Verser une goutte de protéine contenant de l&#39;échantillon de la R-1 et une goutte de précipitant de R-2 (figure 2, l&#39;image 1). Fusionner les deux gouttelettes et de permettre la gouttelette combinée à incuber pendant 5 min, ce qui entraîne la précipitation de la proteins sur la surface (figure 2, Cadres 2-3). Actionner le surnageant loin de la protéine précipitée dans le réservoir de déchets, R-3 (figure 2, Frame 4). </li><li> Distribuer trois gouttes de tampon de lavage de la R-4 et les conduire à travers la protéine précipitée dans le réservoir de déchets, R-3 (figure 2, Frame 5). </li><li> Laisser le précipité à sécher, et dispenser une goutte de tampon resolubilizing de R-5 à la protéine. Laisser le tampon à incuber pendant 20 min jusqu&#39;à ce que le précipité soit dissous (figure 2, cadre 6). </li><li> Verser une goutte d&#39;un réducteur de la R-6 et la fusionner avec la goutte d&#39;échantillon. Mélanger la gouttelette combinée par l&#39;actionner à travers 6 électrodes dans un modèle circulaire. Autoriser la gouttelette à incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée (Figure 3, Cadres 1-2). </li><li> Verser une goutte d&#39;agent d&#39;alkylation de la R-7 et la fusionner avec la goutte de l&#39;échantillon, suivie d&#39;un mélange (comme dans 4.5). Autoriser la gouttelette à incuber pendant 15 min à température ambiante dans une chambre humidifiée, protégé de la lumière (figure 3, Cadres 2-3). </li><li> Verser une goutte de trypsine de la R-8, et la fusionner avec la goutte de l&#39;échantillon, suivie d&#39;un mélange (comme dans 4.5). Autoriser la gouttelette à incuber pendant 3 h à 37 ° C dans une chambre humidifiée sur une plaque chauffante (figure 3, Cadres 3-4). </li></ol> Partie 5: Préparation des échantillons post-traitement <ol><li> Enlever le substrat supérieur et de la réaction de digestion en ajoutant 0,6 étancher ml d&#39;acide trifluoroacétique 2,5% dans l&#39;eau. </li><li> Purifier produit de la réaction en utilisant trempé ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) selon les instructions du fabricant. </li><li> Diluer l&#39;échantillon dans de l&#39;eau purifiée DI pour un volume final de 100 ml. </li></ol> Partie 6: Spectrométrie de Masse <ol><li> Évaluer l&#39;échantillon traité sur une nano-HPLC couplé à un spectromètre de masse en tandem. Le système HPLC utilisé ici est de Technologies Eksigent et est équipé d&#39;une colonne piège (3 mm de diamètre. Perles C18, 150 ID um x 2,5 cm) et une colonne de séparation en phase inverse (3 dia um. Perles C18, 75 um x ID 15 cm). Le spectromètre de masse utilisé ici est un LTQ de Thermo Fisher Scientific-. </li><li> Charger un échantillon de 2 uL sur la colonne piège à 5μL/min dans une phase mobile comprenant 5% d&#39;acétonitrile dans l&#39;eau. Séparer l&#39;échantillon sur la colonne de phase inverse à 0.5μL/min utilisant un gradient linéaire de 20% d&#39;acétonitrile à 80% d&#39;acétonitrile en 25 min. Continuer l&#39;exécution à 80% d&#39;acétonitrile pendant 10 minutes supplémentaires. </li><li> Analyser les bandes élution de la colonne par spectrométrie de masse en tandem. Dans le travail présenté ici, l&#39;éluant est échantillonné dans le spectromètre de masse via un émetteur nanoélectrospray (20 um ID conique à 10 um ID) de NewObjective. </li><li> Identifier les protéines de l&#39;échantillon en utilisant un programme de recherche de bases de données telles que SEQUEST. Dans ce travail, nous avons utilisé la version de SEQUEST incorporés dans Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific), et les protéines identifiées ont obtenu des scores probabilité inférieure à 1.0E-03 (équivalent à 99,9% intervalle de confiance), et les couvertures séquence d&#39;au au moins 30% (figure 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Figure 1. (A) Une image un dispositif DMF accouplés à 40 broches pour l&#39;actionnement de gouttelettes automatisés. (B) Un schéma d&#39;un dispositif illustrant le positionnement de l&#39;échantillon et les réactifs nécessaires pour un bilan de protéomique. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Cadres Figure 2. Partir d&#39;un film illustrant l&#39;extraction et la purification automatisée de BSA dans 20% de TCA (précipitant) et d&#39;acétonitrile 70/30% de chloroforme / (solution de rinçage). Dans cadre 6, la protéine précipitée est redissous dans une gouttelette de 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Figure 3. Images d&#39;un film illustrant la réduction séquentielle, l&#39;alkylation, et la digestion d&#39;une gouttelette de protéine resolubilisé. Dans cette figure, les réactifs sont colorés avec des teintures pour plus de clarté, dans la pratique, les réactifs ne sont pas colorées. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Figure 4. Chromatogramme MS d&#39;un échantillon de sérum albumine bovine traitée par microfluidique digitale. 25 peptides distincts ont été identifiés (99,9% intervalle de confiance) correspondant une couverture séquence de 44%.

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	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

Le manque de manipulation des échantillons et le traitement standardisé de la protéomique est une limitation majeure pour le champ. De plus, la manipulation des échantillons conventionnels macroscopique implique plusieurs conteneurs et les transferts de solution, qui peut conduire à des pertes et la contamination de l&#39;échantillon. Une solution potentielle à ces problèmes est de former des systèmes intégrés pour le traitement des échantillons en s&#39;appuyant sur ​​une microfluidique digit...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Protéomique clinique est apparue comme une discipline importante nouvelle, promettant la découverte de biomarqueurs qui seront utiles pour le diagnostic précoce et le pronostic de la maladie. Bien cliniques méthodes protéomiques varient largement, une caractéristique commune est le besoin de (i) l&#39;extraction de protéines à partir de liquides extrêmement hétérogènes (c&#39;est à dire le sérum, le sang total, etc) et (ii) un traitement complet avant l&#39;analyse biochimique. Ici, nous rapportons une nouvelle microfluidique digitale (DMF) méthode fondée intégrant plusieurs étapes de traitement utilisées en protéomique clinique. Cela inclut l&#39;extraction des protéines, resolubilisation, la réduction, l&#39;alkylation et la digestion enzymatique. Numérique microfluidique est un micro dynamique des fluides technique dans laquelle des gouttelettes d&#39;nanolitre-microlitre entreprises sont manipulés sur une surface ouverte. Les gouttelettes sont positionnées sur le dessus d&#39;un réseau d&#39;électrodes qui sont recouverts par une couche diélectrique - quand un potentiel électrique est appliqué à la goutte, des charges s&#39;accumulent sur chaque côté du diélectrique. Les charges électrostatiques servent de poignées qui peuvent être utilisés pour contrôler la position des gouttelettes, et par une séquence de polarisation des électrodes en série, des gouttelettes peut être fait pour passer, déplacer, fusionner, mélanger et diviser sur la surface. Par conséquent, le DMF est un choix naturel pour le transport rapide, séquentielle, en plusieurs étapes, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Cela représente une avancée significative par rapport aux méthodes conventionnelles (en s&#39;appuyant sur pipetage manuel ou des robots), et a le potentiel pour être un outil utile dans la nouvelle protéomique clinique. Maïs J. Djebrail, Vivienne N. Luk, et Steve CC Shih contribué également à ce travail. Adresse actuelle Sergio LS Freire est à l&#39;Université des Sciences de Philadelphie situé au 600, rue du Sud 43ème, Philadelphie, PA 19104.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Microfluidique digitale est une technique caractérisée par la manipulation de gouttelettes discrètes (~ nL - ml) sur un réseau d&#39;électrodes par l&#39;application de champs électriques. Il est bien adapté pour la réalisation rapide, séquentielle, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Ici, nous rapportons une plate-forme capable d&#39;automatiser plusieurs étapes de traitement protéomique.

Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vues.  University of Toronto. Microfluidique digitale est une technique caractérisée par la manipulation de gouttelettes discrètes (~ nL - ml) sur un réseau d'électrodes par l'application de champs électriques. Il est bien adapté pour la réalisation rapide, séquentielle, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Ici, nous rapportons une plate-forme capable d'automatiser plusieurs étapes de traitement protéomique.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Réponse chimiotactique des micro-organismes marins à l&#39;échelle micro nutriments des couches

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Recherche

Biologie

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Les études de chimiotactisme bactérien microfluidique - Interview

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

En appliquant la microfluidique à l&#39;électrophysiologie

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Séparation électrophorétique de protéines

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Analyse immunoblot

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloration protéines dans les gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

L&#39;induction ou à toxines et d&#39;extraction de protéines à partir Fusarium Spp. Cultures pour les études protéomiques

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

L&#39;éviscération des corps vitré et la rétine de la souris pour les analyses protéomiques

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...