La question est de savoir pourquoi seules certaines personnes exposées aux piqûres de tiques développent des réactions allergiques. Pour nous, l’élucidation des biomolécules dans la salive des tiques et les mécanismes immunitaires impliquant ce processus est essentielle pour répondre à cette question. Le modèle animal de poisson zèbre du syndrome alpha-Gal reproduit les modèles comportementaux humains et les réactions allergiques en réponse à la salive des tiques.
Cette approche expérimentale fait progresser la compréhension de l’interaction moléculaire tique-hôte dans laquelle nous avons un conflit associé au syndrome alpha-Gal et la coopération associée à la réponse anticorps à alpha-Gal, qui protègent contre l’infection pathogène. Pour traiter le poisson avec de la salive de tique, répartissez le poisson-zèbre adulte en trois groupes équilibrés entre les sexes. Utilisez le Gala1-3Gal-BSA 3 commercial ou l’alpha-Gal comme témoin positif et le PBS comme témoin négatif.
Pour l’extraction de la salive, utilisez des tiques femelles semi-engorgées, exemptes d’agents pathogènes, nourries pendant six à sept jours avec des cochons d’Inde. Traiter la tique avec cinq microlitres d’une solution à 2% de chlorhydrate de pilocarpine dans PBS à pH 7,4 dans l’hémocèle à l’aide d’une seringue de 50 microlitres avec une aiguille de 0,33 millimètre. Recueillir la salive de l’hypostome des tiques à l’aide d’un embout de 10 microlitres monté sur une micropipette.
Placez la salive dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Déterminer la concentration de protéines salivaires pour établir la quantité de protéines à injecter dans le poisson à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines BCA, en suivant les recommandations du fabricant. Maintenir le poisson zèbre dans un système d’eau à écoulement continu à 27 degrés Celsius avec un cycle lumière-obscurité de 14 à 10 heures.
Ensuite, sélectionnez 10 poissons par groupe avec un ratio similaire de femelles par rapport aux mâles et un poids similaire pour l’injection. Anesthésier brièvement le poisson par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne à 0,02 %. Placez soigneusement le poisson anesthésié sur sa moitié du côté à l’aide d’une pince ou des mains, sur une éponge humide, avec la nageoire caudale du côté droit pour injecter les composés dans le même sens pour contrôler les lésions.
Injecter des groupes de poissons par voie intradermique dans le muscle avec une seringue de 100 microlitres munie d’une aiguille d’un centimètre de calibre 29 à cinq millimètres de la nageoire caudale et à un angle de 45 degrés par rapport au corps du poisson. Après l’injection, replacez le poisson traité dans un réservoir d’eau douce sans anesthésie pour la récupération. Nourrissez les poissons deux fois par jour à 9 h 30.
et 13 h 30 avec 50 à 70 microgrammes de nourriture sèche pour poissons par poisson jusqu’au deuxième jour. Ensuite, écrasez la nourriture pour chiens avec un mortier et un pilon pour nourrir le poisson du deuxième jour après l’injection du traitement jusqu’à la fin de l’expérience le huitième jour.
Pour le prélèvement d’échantillons, fixez le poisson euthanasié sur une plaque de paraffine avec des épingles. Prélever le sérum des vaisseaux sanguins branchiaux du poisson lorsque les branchies sont encore irriguées avec du sang à l’aide d’une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille d’un centimètre de calibre 29. Conservez le sérum recueilli dans un tube de 1,5 millilitre à 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
Coupez le poisson sagittalement avec une lame de scalpel et évaluez les lésions internes. Ensuite, recueillez l’intestin et le rein de chaque poisson dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Extraire l’ARN total de l’intestin et des reins à l’aide d’un kit de purification de l’ARN.
Analyser l’expression des gènes liés à la réponse immunitaire, en effectuant une réaction quantitative en chaîne de transcription inverse-polymérase, ou RT-qPCR en utilisant un mélange de transcription inverse pour RT-qPCR, selon les instructions du fabricant. Normaliser les valeurs cT de l’ARNm contre le GAPDH du poisson zèbre et comparer entre les groupes à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale. Déterminer les titres d’anticorps IgM qui reconnaissent l’alpha-Gal dans les échantillons de sérum par ELISA.
Enregistrez les titres d’anticorps sous forme de valeurs de densité optique de 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques et comparez entre les groupes à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale. Ce modèle de poisson zèbre permet la caractérisation et l’évaluation de diverses réactions allergiques dues à la réponse de l’hôte à la salive des tiques et à leur implication dans le syndrome alpha-Gal, ou AGS. De plus, par rapport au poisson témoin, des altérations de comportements tels que nager lentement, s’allonger sur le fond de l’aquarium et ne pas manger, vibrer ou zigzaguer ont été observées chez les poissons traités à la salive des tiques.
Une incidence significative de réactions allergiques a été observée chez les poissons traités avec de la salive de tique, montrant une désensibilisation et une tolérance rapides. Le changement de comportement était plus prononcé chez les poissons traités avec de la salive de tique qu’avec de l’alpha-Gal. Une analyse supplémentaire de l’expression des marqueurs immunitaires représentatifs a été réalisée par RT-PCR.
Les résultats ont montré des différences entre les groupes de poissons-zèbres dans le rein, où les marqueurs de réponse immunitaire ont été régulés à la baisse chez les poissons traités avec de la salive et de l’alpha-Gal par rapport au groupe témoin. De plus, le poisson zèbre traité avec de la salive et de l’alpha-Gal a développé des anticorps IgM contre l’alpha-Gal qui ont montré des niveaux plus élevés que chez les poissons traités avec du PBS. L’injection du traitement, l’évaluation des réactions allergiques et du comportement, et le rapport du nombre de poissons morts de réactions allergiques sont l’aspect le plus important du protocole.
L’utilisation de technologies omiques au niveau de l’ARNm, des protéines et du microbiome pour caractériser la réponse à la salive des tiques nous permet d’identifier les biomolécules clés impliquées dans ce processus.
