This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88&#8211;/&#8211; mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.

Toutes les expériences animales ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation Comité animale de l&#39;Université du Texas Medical Branch. 1. Isolement des PED de souris non infectées et infectées par le VNO <ol><li> Match de l&#39;âge et le sexe 6-10 semaines-vieux, de type sauvage C57BL / 6 (B6) et MyD88 - / - souris. Inoculer par voie intrapéritonéale (ip) avec 500 unités formant des plaques (PFU) du VNO NS4B- P38G mutant. Au jour 3 après l&#39;infection, euthanasier B6 et MyD88 - / - souris avec du CO 2. Utilisation des souris non infectées de deux groupes comme témoins. Utilisez trois souris de chaque groupe. </li><li> Fourrure mouillée sur le côté gauche de la souris sacrifiées en utilisant 70% d&#39;éthanol et coupé la fourrure le long du côté gauche de la souris, à mi-chemin entre les jambes avant et arrière. Couper ouvrir la cavité du corps. Retirer la rate en utilisant les forceps. Placez la rate dans une boîte de Pétri avec du RPMI. </li><li> Isoler DC spléniques en utilisant des billes magnétiques anti-CD11c selonles instructions du fabricant. </li></ol> 2. Purification et d&#39;étiquetage des cellules T de souris transgéniques OTII <ol><li> Récolte une rate d&#39;une souris OTII naïve comme décrit dans l&#39;étape 1.2 ci-dessus et homogénéiser la rate entre les extrémités de deux diapositives givrées. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml, ajouter du milieu RPMI à 14 ml. Laissez la suspension reposer pendant 5 min et 13 ml de transférer à un nouveau tube de 15 ml conique. </li><li> Isoler les cellules T CD4 + spléniques en utilisant un kit T CD4 + d&#39;isolement des cellules selon les instructions du fabricant. </li><li> des cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml, rincer deux fois avec du PBS. Resuspendre les cellules dans du PBS avec 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) à 1 x 10 6 cellules par ml, et ajouter 0,5 pmol / ml de CFSE. Incuber à 37 ° C pendant 10 min, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu complet froid (RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 1/100 voldes antibiotiques / antimycosiques, 1/100 en volume de L-glutamine et 1/1000 x 1000 vol de 2-mercaptoéthanol). </li><li> Incuber sur de la glace pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS, fixent 0,2 x 10 6 cellules T CD4 + marquées dans 2% de PFA et d&#39;acquérir sur un cytomètre de flux. Utilisez cet exemple pour déterminer le niveau de base de CFSE. Re-suspendre le reste de cellules marquées dans un milieu complet. </li></ol> 3. Co-culture OTII cellules T avec DC de souris infectées par le VNO <ol><li> Culture 2 x 10 5 cellules T CD4 + purifiées de souris OTII seul ou avec PED purifiées de type sauvage ou MyD88 - / - souris (2 x 10 4) dans une plaque à 24 puits avec ou sans OVA résidus 323-339 (1 g / ml) dans 1 ml de milieu complet par puits. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 jours. cellules de récolte, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS avec 1% de FBS) et fixent dans 0,25 ml 2% PFA. Vortexer immédiatement. </li></ol> 4. cytométrie en flux in vitro &lt;/ Em&gt; T Cell Amorçage <ol><li> Pour l&#39;acquisition, double-cliquez sur l&#39;icône de la cytométrie de flux logiciel. Pour une parcelle de densité linéaire FSC-A vs SSC-linéaire A, sélectionnez canaux 0 à 200 000 sur FSC-A et de 0 à 200 000 le SSC-A. Ensuite, créez une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 1A). </li><li> Pour analyser l&#39;intensité de fluorescence de CFSE, ouvrez l&#39;histogramme pour le canal FL1 et d&#39;acquérir 20 000 événements sur la population fermée. Mettre en place un marqueur sur des échantillons pour les cellules OTII cultivées seules (figure 1A). </li><li> Acquérir des échantillons de cellules OTII co-cultivées avec des DC de type sauvage (figure 1B) ou MyD88 - / - PED (figure 1C) d&#39;une manière similaire. </li></ol> 5. Isolement et stimulation de splénocytes pour dosages de cytokines <ol><li> Infecter B6 et MyD88 - / - souris avec mutant VNO NS4B-P38G en utilisant la même procédure que celle décrite dans ste1,1 p. Au jour 30 post-infection, nouveau défi souris survivantes avec 2000 UFP de type sauvage VNO souche ip Au jour 8 et 21 infection par le VNO post-primaire ou au jour 4 après l&#39;infection secondaire, euthanasier les souris avec du CO 2 pour la collecte des rates . NOTE: Nous avons utilisé 2-3 souris par groupe pour chaque point de temps. </li><li> Faire une suspension cellulaire unique de splénocytes comme décrit ci-dessus dans l&#39;étape 1.2 et 2.2 étape. Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et remettre en suspension dans 10 ml eux de milieu complet. </li><li> Diluer les cellules avec du milieu complet à 2,5 x 10 6 cellules / ml. Ajouter 1 ml de splénocytes dans 1,5 ml d&#39;un tube de micro-centrifugeuse. </li><li> Pour simuler les cellules T CD8 +, diluer NS4B et E peptides spécifiques de l&#39;infection par le VNO (SSVWNATTA et IALTFLAV) à 1 mg / ml dans du DMSO. Pour la stimulation des cellules T CD4 +, diluer NS3 et E peptides spécifiques de l&#39;infection par le VNO (RRWCFDGPRTNTILE et PVGRLVTVNPFVSVA) à 1 mg / ml dans du DMSO. Ajouter 10 ul de peptides aux cellules followed par une pi d&#39;une solution Bréfeldine. Utiliser des cellules sans traitement des peptides comme témoins. Mélanger les cellules. </li><li> Poinçon deux trous avec une aiguille de 18 G dans le bouchon du tube. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 heures. </li></ol> 6. intracellulaire de cytokines coloration <ol><li> cellules de transfert à un nouveau tube de micro-centrifugeuse. Spin cellules pendant 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. Ajouter 1 ml tampon FACS, rotation 5 min à 300-400 xg et remettre en suspension les cellules par pipetage avec 120 ul tampon FACS. </li><li> Ajouter 2 ul de Fc de blocage et incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min. Ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Spin 5 min à 300-400 x g. </li><li> Re-suspendre les cellules dans 300 pi FACS tampon et les diviser en trois tubes (environ 0,8 x 10 6 cellules par tube). Comme le montre le tableau 1, se réserver le premier tube de chaque condition de culture de rat IgG-PE coloration. Pour le second tube, ajouter 3 ul d&#39;anti-CD4 APC pour CD4 peptides cellules traitées, 3 μl d&#39;anti-CD8 FITC à des cellules CD8-peptides traités à la fois des anticorps ou des cellules sans traitement des peptides. Utilisez le troisième tube d&#39;indemnisation coloration. Pour chaque condition de culture, utiliser trois tubes de cellules colorées avec APC conjugué CD4, CD8 conjugué au FITC ou PE- anticorps marqués CD3 seul (3 pi par tube) que les contrôles de compensation pour FL1, FL2 et des canaux de FL4. </li><li> cellules Vortex brièvement. Laisser sur la glace pendant 20 min et protéger de la lumière. Ajouter 1,4 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 xg et verser le surnageant. </li><li> Agiter à perturber culot cellulaire (ou vortex brièvement). Re-suspendre culot cellulaire dans 250 pi de fixation / perméabilisation solutionby pipetage. Incuber à température ambiante pendant 20 min et à protéger de la lumière. </li><li> Ajouter 1,2 ml de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans un tampon FACS 300 pi. NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être transférés à un laboratoire BL2 pour un traitement ultérieur ou stocké dans un réfrigérateur et protégé de la lumière pour up à trois jours. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon FACS. Spin 5 min à 300-400 cellules XG et remettre en suspension dans 500 pi de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. </li><li> Re-suspendre les cellules dans 100 ul 1x Perm / Wash, ajouter 3,5 pi anti-IFN-PE au tube précédemment ajouté avec des anticorps pour CD4 et ou marqueurs cellulaires / T CD8 à l&#39;étape 6.3 et 3.5 pi rat IgG-PE dans le tube réservé pour le contrôle IgG pendant 25 min sur de la glace et de protéger de la lumière. Laver les cellules en ajoutant 1,4 ml de tampon perméabilisation / lavage 1x. Spin 5 min à 300-400 x g. Répétez l&#39;étape de lavage en ajoutant 1,4 ml 1x tampon perméabilisation / lavage. </li><li> Spin 5 min à 300-400 xg et décanter surnageant. Laver les cellules par addition de 1,4 ml de tampon FACS et remettre en suspension dans 400 ul de tampon pour FACS pour l&#39;acquisition finale. </li></ol> 7. cytométrie en flux de cytokine intracellulaire coloration <ol><li> Utilisez les mêmes paramètres d&#39;acquisition comme dans l&#39;étape 4.1. Create une porte sur des cellules vivantes (P2; voir la figure 2A). Réglez les tensions en utilisant les tubes de rémunération pour chaque groupe. </li><li> Ouvrez deux nouveaux tracés de points, une pour afficher les données recueillies pour FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), et l&#39;autre est d&#39;afficher les données collectées pour FL4 vs. FL2 (vs CD4. IFN-γ). Acquérir 50 000 événements pour la population fermée de chaque échantillon. </li></ol>

<ol>
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Dis. 7, 2275 (2013).</li><li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vgamma4++T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection.">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l&#39;équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l&#39;infection par le VNO 5. Dans les deux essais, les cellules infecté...

Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain 1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche 2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques appropriées pour un candidat vaccin idéal. Les mécanismes par lesquels le mutant NS4B-P38G induit haute immunité adaptative de protection ne sont pas encore clairement compris. Toll-like récepteurs (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes, jouent un rôle essentiel dans le déclenchement de l&#39;immunité innée à l&#39;infection virale. La voie de signalisation de TLR de base utilise réponse différenciation myéloïde primaire geNE 88 (MyD88) comme carte principale 3,4. Dans une étude récente, la signalisation MyD88 a été montré à jouer un rôle important dans le développement de l&#39;immunité à médiation cellulaire au cours VNO NS4B- P38G infection chez la souris mutante 5. Cellules dendritiques (CD) sont une des plus importantes cellules présentatrices d&#39;antigène présentant la capacité unique d&#39;initier les réponses des cellules T primaires lors de l&#39;infection virale 6,7. Lymphocytes T CD4 + et CD8 + contribuent tous deux à l&#39;immunité protectrice de longue durée et sont importants pour la survie de l&#39;hôte après-type sauvage infection par le VNO 8,9. Deux dosages immunologiques ont été utilisés dans cette étude pour évaluer les fonctions de ces cellules chez les souris mutantes infecté NS4B-P38G. Tout d&#39;abord, un test d&#39;amorçage de cellules T in vitro a été utilisé pour comparer la capacité de présentation antigénique des CD de type sauvage du VNO-infectés et MyD88 - / - souris. Pour augmenter la sensibilité du test, naïfs CD4 &lt;sup&gt; + cellules T ont été isolés à partir de OTII souris transgéniques, qui expriment une spécifique Vα2 / Vβ5 TCR pour l&#39;ovalbumine de poulet (OVA) peptide 323 - ont été purifiés 339. PED de souris infectées par le VNO, et co-cultivées avec carboxyfluorescéine succinimidyl pâques (CFSE ) marqué à des cellules T CD4 + en présence de peptide OVA. Après 5 jours de co-culture, les cellules ont été récoltées et fixées avec du paraformaldehyde (PFA) et analysées par cytométrie en flux. Des dosages de prolifération ont été traditionnellement réalisée par incorporation de 5-bromo-2&#39;-désoxyuridine (BrdU) ou désoxyriboside de thymine tritiée (3 HTdr) 10. Néanmoins, ces tests sont soit radioactifs et / ou dans le besoin d&#39;équipements spéciaux au niveau de biosécurité (BL) 3 des installations, où des études de VNO sont menées. L&#39;analyse par cytométrie de flux de la prolifération des lymphocytes par division par deux en série de l&#39;intensité de fluorescence du colorant vital CFSE est devenue plus couramment utilisé dans des essais immunologiques comme le colorant est plus stableet incorporé uniformément dans les cellules, facilement détectée par cytométrie de flux, et est non-radioactif 11. L&#39;essai a également la possibilité d&#39;évaluer le nombre de divisions cellulaires. Un avantage majeur de l&#39;utilisation de ce test dans les études VNO est que la fixation des cellules infectées avec 1-2% PFA pourrait inactiver VNO 12, ce qui permettra l&#39;acquisition de l&#39;échantillon avec un cytomètre de flux dans un laboratoire de BL2. Ensuite, une procédure coloration de cytokine intracellulaire modifié (ICS) a été utilisé pour étudier le rôle de signalisation MyD88 dans la régulation de réponses des lymphocytes T spécifiques du VNO chez les souris mutantes infectées NS4B-P38G. Dans ce dosage, les splénocytes isolés à partir de souris infectées ont été traitées in vitro avec des peptides spécifiques VNO. Bréfeldine A a été ajouté à retenir les cytokines dans la cellule. Après 5 heures d&#39;incubation, les cellules ont été récoltées, lavées et colorées pour des sous-ensembles de cellules T. Les cellules ont ensuite été fixées dans PFA, perméabilisées et colorées pour l&#39;interféron (IFN) -γ et analysées par cytométrie en flux.Comme avec d&#39;autres dosage à base de cytométrie en flux, une fois que les cellules sont traitées avec un tampon de fixation et perméabilisation contenant PFA, les échantillons infectés peuvent être transférés à un laboratoire de BL2 pour un traitement ultérieur et d&#39;analyse. Dans plusieurs études publiées, nous avons utilisé ICS pour mesurer les fonctions T effectrices de cellules chez des souris infectées par le VNO 13,14. Bien qu&#39;il soit bien établi, un inconvénient majeur de ce test est que la procédure est très longue et pourrait être plus de temps lorsqu&#39;il est effectué à l&#39;intérieur des installations BL3. Ici, un procédé à base d&#39;ICS tube de micro-centrifugeuse de se est révélé être plus facile, plus facile de procéder et moins de temps lorsqu&#39;il est effectué dans un laboratoire BL3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11875</td>
			<td>warm up at 37C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD11c magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD4 magnetic beads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-248</td>
			<td>follow the manufacturer&#8217;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFSE</td>
			<td style="width:153px;">Invitrogen</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OVA residue 323-339</td>
			<td>Genscript Corporation</td>
			<td>RP10610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">Peptides</td>
			<td style="width:153px;">Proimmune</td>
			<td>PC0AD-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Brefeldin A solution</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td align="right">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Mouse Fc Blocker</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>14-0161-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">APC-conjugated CD4&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>17-0041-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">FITC-conjugated CD8&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e- bioscience</td>
			<td>11-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Fixation/Permeabilization Solution</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">Permeabilization/wash buffer</td>
			<td style="width:153px;">BD- Bioscience</td>
			<td align="right">554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;">anti-IFNg-PE&#160;</td>
			<td style="width:153px;">e-Bioscience</td>
			<td>12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:216px;">Accuri flow cytometer</td>
			<td style="width:153px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of myd88-mediated cellular immune response to west nile virus mutant strain infection

Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l&#39;amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie-- in vitro des cellules T dosage dans l&#39;amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) - ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l&#39;ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) - marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 +. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 + est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l&#39;ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l&#39;infection par le VNO.

Dans l&#39;essai d&#39;amorçage des cellules T, les cellules T CD4 + marquées CFSE ont été cultivées avec des DC purifié à partir du type sauvage NS4B-P38G mutant infecté et MyD88 - / - souris en présence ou en l&#39;absence de peptides OVA. Les cellules T cultivées seules marqués avec ou sans OVA pendant 5 jours ont été utilisés comme témoins négatifs. Comme le montre la figure 1A, les cellules T totaux ont été bloqués pour l&#39;analyse de l&#39;intensité de f...

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

8.1K vues.  The University of Texas Medical Branch. Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Recherche

Immunologie et infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sept étapes pour Stellate Cellules

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Une introduction à guêpes parasites<em&gt; Drosophila</em&gt; Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

PRP comme une nouvelle approche pour prévenir l&#39;infection: Préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Propriétés antimicrobiennes de PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...