Cette méthode permet aux utilisateurs de suivre facilement les lymphocytes T in vivo afin d’évaluer la cinétique du homing et de surveiller la persistance des lymphocytes T. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être répétée à plusieurs moments sur le même animal sans nécessiter de sacrifice en cytométrie de flux ou en immunohistochimie. Cette technique pourrait également être modifiée pour suivre d’autres types de cellules immunitaires.
Pour cultiver des cellules 293T, préparez un litre de DMEM en ajoutant 110 millilitres de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 11 millilitres de streptomycine pénicilline. Décongeler cinq fois 10 à la sixième cellule 293T et les transférer dans une fiole T175 contenant du DMEM. Divisez les cellules une à 10 tous les trois jours pendant six jours avant que les cellules ne deviennent confluentes à plus de 90%.
Pour la transfection, transférer 1,5 millilitre de média dans deux tubes de 50 millilitres à l’aide d’une pipette. Dans un tube, ajouter 10 microgrammes de plasmide VSVG, 20 microgrammes de pol bâillon et 20 microgrammes de TDtomate rouge de cliquetère ou de plasmide luciférase CBRTDR et mélanger. Ajouter 100 microlitres de réactif de transfection in vitro d’ADN dans un autre tube et mélanger.
Incuber les deux tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Transférer goutte à goutte le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN dans le tube contenant les plasmides d’ADN et mélanger doucement à l’aide d’une pipette. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
Pendant l’incubation, détacher les cellules 293T en ajoutant cinq à 10 millilitres de trypsine à 0,05%. Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de média et centrifugez à 800 G pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans 1,5 millilitre de média.
Ajouter le milieu contenant le réactif de transfection in vitro de l’ADN et les plasmides d’ADN aux cellules 293T et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après incubation, transférer la suspension dans une fiole T175. Ajouter 18 millilitres de média et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, aspirez soigneusement le média avec une pipette en verre sans détacher les cellules et remplacez-le par 18 millilitres de média frais. Encore une fois, incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, retirer le surnageant viral à l’aide d’une pipette placée sur de la glace et centrifuger à 800 G pendant cinq minutes pour enduire les cellules et les débris.
Filtrez le surnageant viral à l’aide d’un filtre de 0,22 micron et placez-le immédiatement sur de la glace. Pour l’activation in vitro des lymphocytes T humains, ajoutez 10 millilitres de PBS contenant 0,1% d’albumine sérique bovine ou BSA et deux EDTA millimolaires dans un tube stérile de 15 millilitres. Ensuite, pour laver les perles, ajoutez des perles dans un tube et placez le tube dans une grille magnétique.
Après deux minutes, retirez le PBS du tube. Après avoir préparé DMEM, ajouter des billes lavées et de l’interleukine-2 ou de l’IL-2 à une concentration finale de 30 unités internationales par millilitre. Comptez les cellules T à l’aide d’un cytomètre hémologique et d’une coloration bleue de trypan.
Après le comptage, ajoutez le nombre souhaité de lymphocytes T dans le milieu et inversez doucement le tube pour mélanger. Plaque de 2,5 millilitres de milieu contenant deux millions de lymphocytes T, des billes et de l’IL-2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Culture à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone humidifié à 5%.
Examinez les lymphocytes T sous un objectif 20X tous les jours pendant trois jours pour déterminer quand transduire avec la luciférase. Ensuite, pour préparer une plaque de rétroNectine, ajoutez deux millilitres de 20 microgrammes par millilitre de rétroNectine dans du PBS à un puits d’une plaque à six puits non traitée et incuber pendant deux heures à température ambiante. Aspirez la RetroNectin sans rayer le fond de la plaque et ajoutez trois millilitres de 2% BSA dans PBS par puits dans la plaque de six puits.
Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, pour la spinoculation, aspirez le BSA et lavez les puits une fois avec trois millilitres de PBS. Continuer ou remplacer par du PBS frais et laisser la plaque couverte à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, ajouter deux millilitres de surnageant viral CBRTDR luciférase par puits et centrifuger à 1 240 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius. Pour la transduction, après avoir compté les cellules T, aspirer le surnageant viral et plaquer deux millions de cellules T par puits dans six millilitres de DMEM contenant 30 unités internationales par millilitre d’IL-2 humaine. Examinez les lymphocytes T pendant deux jours.
Lorsque les cellules sont presque confluentes, les laver délicatement du fond de la plaque à l’aide d’une pipette et transférer chaque puits dans une fiole T75 séparée. Ajouter neuf millilitres de média pour un volume total de 15 millilitres par fiole. Le lendemain, ajoutez 15 millilitres de milieu et confirmez la réussite de la transduction en effectuant une cytométrie en flux.
Après avoir anesthésié la souris, à l’aide d’une aiguille de calibre 26, injecter rétroorbitalement 20 millions de lymphocytes T dans 100 microlitres de média. Administrer 1 000 unités d’IL-2 recombinante par voie sous-cutanée pour soutenir la survie des lymphocytes T in vivo. Ensuite, administrer l’anticorps bispécifique rétroorbitalement ou intrapéritonéale.
Pour l’imagerie in vivo, administrer 100 microlitres de trois milligrammes de D-luciférine par injection rétroorbitale avec une aiguille de calibre 26 dans une souris anesthésiée. Pour capturer des images, placez la souris dans la chambre étanche à la lumière de l’imageur de sorte que le flanc portant la xénogreffe soit orienté vers le haut vers la caméra. À l’aide du panneau de contrôle d’acquisition, sélectionnez luminescent, photographie et superposition.
Réglez le temps d’exposition sur auto, le binning sur moyen et f-stop sur un et acquérir des images. Après la première image, définissez le temps d’exposition pour qu’il corresponde à celui calculé automatiquement pour la première image afin que les images suivantes puissent être comparées directement. Prenez une autre série d’images avec la souris en décubitus dorsal pour évaluer la présence de lymphocytes T dans les poumons.
Les lymphocytes T armés ont trafiqué vers la tumeur plus rapidement que les lymphocytes T non armés, quittant les poumons deux jours plus tôt. La quantification de l’infiltration des lymphocytes T dans les tumeurs au fil du temps a été mesurée par bioluminescence et exprimée en troupeaux totaux ou en radiance par pixel intégré sur le contour tumoral. Le trafic des lymphocytes T a pu être surveillé pendant 28 jours après l’injection des lymphocytes T transduits par la luciférase, ce qui a permis de suivre l’homing et la persistance des lymphocytes T tout au long du traitement.
Le trafic des lymphocytes T dans les xénogreffes de patients atteints de cancer du sein humain HER2 positifs chez des souris DKO est montré. Le traitement par l’anticorps bispécifique HER2 avec un FC non silencieux n’a eu aucun effet sur la croissance tumorale par rapport à un anticorps bispécifique contrôlé. En revanche, le traitement avec un anticorps bispécifique HER2 contenant la mutation N297A seul ou en combinaison avec une mutation K322A a permis d’arrêter complètement la croissance tumorale.
Pour les groupes présentant les mutations silençantes, le signal de luminescence des lymphocytes T a atteint un pic plus élevé le troisième jour après l’injection et a persisté à un niveau plus élevé que l’anticorps bispécifique contrôlé et l’anticorps bispécifique HER2 non silencieux. Les souris portant des xénogreffes dérivées de patients atteints de neuroblastome ont démontré que l’épuisement des macrophages positifs au Ly6C augmentait significativement le homing des lymphocytes T vers les tumeurs, entraînant une diminution de la croissance tumorale et une survie prolongée. L’effet était plus prononcé dans les xénogreffes dérivées de patients atteints d’ostéosarcome.
Parmi les anticorps bispécifiques ciblant l’antigène tumoral STEAP1, le format IGGL SCFV a entraîné une infiltration significativement plus importante des lymphocytes T le sixième jour après la première dose de lymphocytes T qui a persisté pendant toute la durée du traitement. De telles observations n’ont pas été prédites par des essais de cytotoxicité in vitro. Après avoir suivi les cellules T in vivo, les utilisateurs peuvent toujours effectuer une immunohistochimie pour déterminer plus précisément où les cellules T sont situées dans la tumeur ou d’autres tissus normaux.
