Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de l’immunothérapie au sujet de l’évaluation de la cytotoxicité des cellules immunitaires contre les cellules tumorales à structure 3D. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est simple et qu’elle combine une technologie d’imagerie avancée et un essai immunologique sensible. Commencez par laver la ligne d’intérêt des cellules cancéreuses colorectales avec cinq millilitres de PBS et en enlevant les cellules du fond du flacon avec 0,5 millilitres de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.
Après confirmation du détachement au microscope, neutraliser l’enzyme de dissociation cellulaire avec 10 millilitres de milieu complet et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en cinq millilitres de milieu complet frais pour compter et résuspendre les cellules à une concentration de 1,5 fois 10 à la troisième cellule par millilitre de concentration. Puis ensemencer 200 microlitres de cellules dans chaque puits de plaque inférieure ronde de 96 puits et placer la plaque dans un appareil d’imagerie automatisé à l’intérieur d’un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 et 95% d’humidité.
Connectez-vous au logiciel d’acquisition de l’appareil et sélectionnez Schedule to Acquire, Launch Add Vessel, Scan on Schedule et Create Vessel New. Ensuite, sélectionnez le type sphéroïde de type scan et sélectionnez les canaux d’intérêt appropriés pour le champ lumineux et la fluorescence. Réglez le grossissement à 10 fois et sélectionnez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir de l’appareil d’imagerie.
Sélectionnez la position des puits à imager et entrez la description de l’expérience, y compris le nom, le type de cellules et le nombre de cellules. Pour la configuration de l’analyse, sélectionnez Analyse différer jusqu’à plus tard, cliquez à droite sur la chronologie, sélectionnez l’intervalle de groupe d’analyse sélectionné défini et définissez Ajouter des analyses toutes les à quatre heures et pour un total de 24 heures. Réglez ensuite l’heure de départ au moins une heure après l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé.
Pour vérifier l’évolution de la croissance sphéroïde, tous les deux jours, connectez-vous au logiciel d’imagerie et sélectionnez Afficher les analyses récentes. Double clic sur l’expérience d’intérêt et sélectionnez Brightfield dans le panneau Canaux d’image. Utilisez ensuite l’outil Caractéristiques d’image mesure pour mesurer le diamètre des sphéroïdes, en ajoutant 50 microlitres de milieu complet par puits au quatrième jour pour limiter les effets d’évaporation moyenne.
Lorsque les sphéroïdes atteignent la taille expérimentale appropriée, inclinez soigneusement la plaque et utilisez une pipette multicanal pour retirer délicatement 150 microlitres de milieu complet de chaque puits sans déranger les sphéroïdes. Ensuite, remplacez le milieu jeté par 50 microlitres d’une solution d’un à 200 d’Annexin V Red et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 15 minutes. Centrifugeuse transduced CAR CD19 T cells in a 15 milliliter conical tube and resuspend the pellet in two milliliters of complete medium.
Après compter, diluer les cellules à deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration moyenne complète. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules T CD19 CAR à chaque puits contenant des sphéroïdes et retournez la plaque à l’appareil d’imagerie automatisé. Dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez Schedule to Acquire et cliquez à droite sur la chronologie de l’analyse.
Sélectionnez Modifier la chronologie et cliquez à droite sur le groupe d’analyse pour le supprimer. Cliquez à nouveau sur la chronologie et sélectionnez l’intervalle de groupe d’analyse sélectionné défini et définissez Ajouter des analyses toutes les 1 1/2 heures et pour un total de 24 heures. Réglez ensuite l’heure de début de l’imagerie à au moins une heure après le début de l’incubation dans l’appareil d’imagerie automatisé et sélectionnez Enregistrer les analyses d’horaire.
Pour l’analyse automatisée de l’image, dans le logiciel d’analyse, sélectionnez Afficher les analyses récentes et l’analyse de lancement. Sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse et d’analyse type Sphéroïde et définir les canaux d’image à analyser. Sélectionnez au moins 10 images représentatives et prévisualisez la procédure d’analyse par défaut sur l’ensemble de la pile d’images.
Modifiez les paramètres du masque à champ lumineux et prévisualisez la pile d’images, confirmant que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision. Modifiez les paramètres du masque vert et prévisualisez la pile d’images pour confirmer que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision. Modifiez les paramètres du masque rouge et prévisualisez la pile d’images pour confirmer que les paramètres sélectionnés détectent les sphéroïdes avec précision.
Prenez soin d’obtenir le meilleur signal sur le bruit et la sensibilité par rapport aux ratios de spécificité, en gardant à l’esprit que vous ne serez pas en mesure de trouver un ensemble de paramètres qui permettront de capturer chaque événement à chaque point de temps. Lancez ensuite l’analyseur. Lorsque l’analyse est terminée, extraire la mesure de l’intérêt et sélectionner le fichier analysé et l’option de mesure graphique.
Sélectionnez les mesures d’intérêt, l’analyse et le puits. Cliquez sur Données d’exportation pour extraire les mesures sélectionnées dans plusieurs formats de fichiers. Ensuite, pour extraire les images, sélectionnez le fichier analysé et sélectionnez Images et films d’exportation.
L’expression CD19 CAR sur les lymphocytes T transduced et l’expression CD19 sur les cellules cancéreuses colorectales transduced peuvent être confirmées par cytométrie de flux. Ici, le résultat d’une expérience sphéroïde typique peut être observé. Contrairement aux cellules T simulées, les lymphocytes T CD19 CAR sont capables de tuer spécifiquement les sphéroïdes dérivés de la lignée des cellules cancéreuses colorectales, ce qui diminue considérablement le nombre de cellules tumorales vivantes.
Le suivi de l’évolution des signaux verts et rouges totaux à l’intérieur des limites sphéroïdes au fil du temps révèle que peu de temps après l’injection de lymphocytes T CD19 CAR, la taille des sphéroïdes diminue rapidement à mesure que le signal d’apoptose augmente rapidement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme les tests de toxicité, les analyses de migration cellulaire ou les mesures de la structure sphéroïde peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur le dépistage des médicaments, la motilité des lymphes T ou la formation de sphéroïdes, respectivement.
