Ces méthodes peuvent fournir des aperçus mécanistes dans la cytotoxicité immunisée de cellules tumorales et le comportement invasif dans un arrangement 3D. Le principal avantage de cette technique est que ce modèle de co-culture sphéroïde 3D ne nécessite pas le transfert de sphéroïdes pour plusieurs essais ultérieurs. Apsra Nasir, doctorante de notre département, démontrera cette procédure.
Pour générer les sphéroïdes en utilisant la technique aseptique dans une hotte de culture cellulaire ajouter 500 microlitres d’agarose fondue dans un moule en caoutchouc 81 microwell en prenant soin d’éviter les bulles. Lorsque l’agarose s’est solidifiée soigneusement fléchir le moule en caoutchouc pour sortir les moulages agarose dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits. Pour équilibrer les moulages ajouter 2,5 millilitres de milieu de culture cellulaire complété par 10% sérum bovin fœtal dans chaque puits et placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant une heure.
À la fin de l’incubation incliner la plaque pour enlever le milieu de culture cellulaire dans l’environnement d’abord, puis dans la chambre d’ensemencement et soigneusement ensemencer 190 microlitres de la suspension cellulaire préparée à la tumeur dropwise dans chaque chambre d’ensemencement cellulaire. Après une incubation de 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire ajouter à 2,5 millilitres de milieu à l’extérieur de la fonte et retourner la plaque à l’incubateur pendant 48 heures. Pour mettre en place une co-culture des cellules T, réutilisez le nombre approprié de cellules T dans 190 microlitres de culture inappropriée des cellules T, moyen par puits jusqu’à ce que les 12 plaques de puits permettent d’abord l’enlèvement du milieu de culture cellulaire entourant la fonte de l’agarose.
Ensuite, dans la chambre d’ensemencement, sans enlever les sphéroïdes utiliser un microscope léger pour vérifier si des sphéroïdes ont été aspirés et tenant la pipette p200 chargé environ un demi-centimètre au-dessus de chaque fonte soigneusement ensemencer les lymphocytes T sur les moulages d’une manière dropwise sans déloger les sphéroïdes. Lorsque tous les moulages ont été ensemencés soigneusement retourné la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 15 minutes avant d’ajouter milieu de culture cellulaire fraîche complétée par sérum bovin fœtal à l’extérieur de chaque fonte pour une autre incubation de 48 heures. Pour intégrer les co-cultures 3D dans le collagène de type 1 diluer le collagène de stock avec le milieu de base libre de sérum à une concentration de travail finale de trois milligrammes par millilitre et ajouter 11 microlitres de 10X PBS, ajouter 1,2 microlitres d’un hydroxyde de sodium molaire par 100 microlitres de collagène.
Après avoir neutralisé la solution de collagène sur la glace pendant une heure, retirez le milieu de culture cellulaire entourant et à l’intérieur de chaque moulage tel que démontré. Ajouter délicatement le collagène neutralisé un mélange à chaque moulage d’une manière dropwise, et immédiatement retourné la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes avant d’inverser la plaque pendant une heure supplémentaire dans l’incubation. À la fin de l’incubation placer la plaque côté droit dans le capot de biosécurité et ajouter lentement un milieu de culture cellulaire fraîche sur le côté de chaque puits.
Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures. Pour la coloration immunofluorescente des co-cultures 3D intégrées fixer chaque fonte d’agarose entière, y compris les sphéroïdes dans 5,4% formaline pendant la nuit à température ambiante dans une chambre humidifiée. Le lendemain, retirez la formaline entourant le plâtre de l’agarose et utilisez des pinces à pointes lisses pour saisir le coin de chaque matrice de collagène pour permettre aux moulages d’être épluchés des chambres d’ensemencement en un seul mouvement fluide.
Placez chaque patch de collagène dans un seul puits d’une glissière de chambre de huit puits et ajoutez 250 microlitres de 0,5% d’octoxynol à chaque puits. Après une heure à température ambiante remplacer l’octoxynol avec 250 microlitres de solution de blocage. Après une heure à température ambiante ajouter un 250 microlitres du cocktail principal d’anticorps d’intérêt à chaque puits et placer une glissade dans une chambre sombre humidifiée pendant la nuit à température ambiante.
Le lendemain matin, retirez l’anticorps primaire de chaque puits et lavez les puits trois fois avec 300 microlitres de tampon IF pendant cinq minutes à température ambiante par lavage. Après le dernier lavage, ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps secondaire inappropriée à chaque puits pendant une incubation d’une heure à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, retirez l’anticorps et lavez chaque échantillon trois fois avec le tampon IF tel que démontré.
Après le dernier lavage rincer les échantillons avec 300 microlitres de PBS par puits et retirer soigneusement les murs de la glissière de chambre. De sorte que seul le glissière de verre au fond reste. Ajouter 200 microlitres de support de montage à la glissière de verre et déposer soigneusement le glissement de couverture sur l’échantillon sans créer de bulles, puis stocker les échantillons montés dans un endroit sombre et sec pendant la nuit avant l’imagerie par microscopie de fluorescence confocale Voici des configurations expérimentales typiques pour les analyses et ils donnent des échantillons représentatifs et analysables à la fin de l’expérience pour chaque protocole peut être observé.
L’intégration de la culture 3D dans le collagène de type 1 dans les micro puits d’un moulage d’agarose permet de surveiller et d’analyser l’invasion par image J.In cette analyse de deux lignées cellulaires primaires murines et pancréatiques cancéreuses différentes formes sphéroïdes et comportements invasifs ont été observées. La première lignée cellulaire a démontré une formation sphéroïde plus compacte et une invasion hérissée semblable à celle observée pour les invasions de cellules simples. Tandis que la deuxième ligne cellulaire a formé des sphéroïdes qui étaient plus lâches et ont démontré un modèle collectif d’invasion.
La co-culture peut être exécutée avec deux lignées clonales différentes de cellules clonales de tumeur ensemencées en même temps ou avec la tumeur et les lymphocytes T sur la formation sphéroïde de tumeur ou une évaluation suivante d’interaction de T-cellule de tumeur. Pour une évaluation détaillée du comportement invasif, la coloration immunofluorescente et l’imagerie con focale peuvent être effectuées d’une manière à haut débit. La fonte d’agarose permet l’intégration de l’ensemble du système de culture 3D dans la paraffine pour la section en série et la coloration de l’immunohistochimie pour quantifier la relation spatiale entre la tumeur et les cellules T.
Par exemple, l’infiltration des cellules T peut être identifiée et caractérisée par la coloration des marqueurs de surface cellulaire. Cette technique permet l’analyse d’échantillons de patients ainsi que l’utilisation de médicaments stimulants et bloquants pour sonder les interactions cellule T des cellules tumorales.
