Les lymphocytes T Gamma-Delta ont une puissante activité cytotoxique contre de nombreux types de cancer, y compris la leucémie myéloïde aiguë. Cependant, les lymphocytes T Gamma-Delta circulants dans le sang sont relativement rares, en particulier chez les patients malins. La perfusion de lymphocytes T Gamma-Delta expansés X-vivo dérivés du donneur est prometteuse pour réduire la récurrence de la leucémie et améliorer la survie des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë.
La méthode proposée permet d’obtenir plus de 200 000 fois l’expansion des lymphocytes T Gamma-Delta, atteignant des doses thérapeutiquement pertinentes d’un produit de cellules T Gamma-Delta très pur, en trois étapes faciles. Donc, ligaturant un IEL à l’expansion, l’épuisement des cellules alpha bêta T par tri magnétique et l’expansion secondaire de prime avec des APAC. La méthode proposée élargit l’utilité des lymphocytes T Gamma-Delta pour des maladies telles que le cancer et les maladies auto-immunes en créant rapidement un grand nombre de cellules qui peuvent être utilisées sur étagère.
Ce processus pourrait être adapté pour étendre les cellules Gamma-Delta en utilisant différentes méthodes d’enrichissement et en ajoutant des manipulations supplémentaires telles que la transduction. La démonstration de la procédure sera lithée à LA, un technologue en thérapie cellulaire, trois de mon laboratoire. Commencez par l’élutriation de l’échantillon de produit d’effervescence, sur le dispositif de centrifugation à contre-courant, en utilisant un milieu primaire de solution saline équilibrée de Hanks, avec 1% d’albumine sérique humaine et le milieu secondaire de solution saline ou DPBS.
Avec la vitesse de centrifugation d’élutriation à 900 fois G, collectez des fractions en fonction du débit et du temps. Prélever les échantillons de la fraction deux pour effectuer les tests de stérilité, le comptage cellulaire et le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux. À partir de la fraction deux, développez une fraction lymphocytaire pure des cellules en culture à 10 fois 10 jusqu’à la sixième cellule par centimètre carré, avec cinq micromoles par litre d’acide zolédronique et 300 unités par millilitre d’interleukine-2 dans un bioréacteur à système fermé d’un litre.
Incuber le système pendant sept jours à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone. Après l’incubation, récoltez les cellules de la fiole de bioréacteur à système fermé d’un litre. Pour ce faire, soudez stérilement un paquet de transfert d’un litre à la ligne rouge du bioréacteur et utilisez la pompe pharmaceutique appropriée pour transférer les cellules dans le pack de transfert.
Prélever les échantillons pour tester la stérilité du milieu usé, le nombre de cellules et le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux. À partir de l’échantillon restant, remettez les cellules en suspension à cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre, dans un tampon PBS-EDTA contenant 0,5% de HSA et un récepteur de lymphocytes T biotinylés, anticorps spécifique alpha bêta. Et incuber les cellules à deux à huit degrés Celsius en secouant.
Après 15 minutes, laver les cellules avec 600 millilitres de tampon PBS-EDTA contenant 0,5 HSA et centrifuger à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes, à deux à huit degrés Celsius, pour éliminer l’anticorps non lié. Ensuite, remettez les cellules en suspension à environ cinq fois 10 à la huitième cellule par millilitre, dans un tampon PBS-EDTA contenant 0,5% de HSA et 7,5 millilitres par flacon de microbilles spécifiques à l’anti-biotine. Comme décrit précédemment, incuber les cellules en les agitant, avant de centrifuger la suspension cellulaire pour éliminer les microbilles non liées.
Remettez en suspension six fois 10 à la septième cellule par millilitre dans un tampon PBS-EDTA avec 0,5% HSA. Rassemblez-les dans un sac de transfert. Piquez-le lorsque l’instrument l’indique.
Ensuite, installez un ensemble de tubes dans le dispositif de séparation des cellules magnétiques de qualité clinique. Placez les emballages avec le tampon PBS-EDTA et le pack de transfert avec le produit cellulaire dans l’instrument. Pour l’épuisement des lymphocytes T alpha bêta étiquetés, sélectionnez le protocole d’épuisement 1.2 dans le logiciel.
Ensuite, centrifugez le produit cellulaire pour recueillir la fraction cible enrichie en lymphocytes T Gamma-Delta. Re-suspendre les cellules collectées dans le milieu, complété par 10% de sérum AB humain. Effectuer une viabilité du comptage cellulaire et une phénotypage par cytométrie en flux après épuisement.
Amener les cellules à une concentration finale d’environ une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Irradier cinq fois 10 à la septième cellule présentatrice d’antigène artificiel ou APAC par flacon, à 100 gris sur l’instrument générateur de rayons X. Préparer une co-culture, en plaçant les APAC irradiés et les lymphocytes T Gamma-Delta au rapport de 10 pour un, dans des flacons de bioréacteur à système fermé d’un litre.
Avec un litre de milieu de culture, complété par 10% de sérum AB humain, semez jusqu’à 10 flacons. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 10 jours, avec un dépistage des niveaux de glucose et de lactate tous les trois à quatre jours à l’aide de bandelettes, de glucose et d’un compteur de lactate. Si le taux de glucose tombe à 215 milligrammes par décilitre, réduisez le volume dans la fiole à 200 millilitres.
Mélanger les cellules dans les 200 millilitres restants de milieu et prélever un échantillon de 0,5 millilitre pour le comptage cellulaire et la mesure de la viabilité par coloration à l’orange acridine ou à l’iodure de propidium. Si le nombre de cellules est égal ou supérieur à 10 à la neuvième, divisez le contenu d’une fiole en deux et remplissez chaque fiole jusqu’à un litre avec un milieu AIM-V, complété par du sérum AB humain à 10%. Si le nombre de cellules est inférieur à 10 à la neuvième, nourrissez les cellules avec un milieu de culture frais d’un litre, complété par du sérum AB humain à 10%, et retournez les flacons à l’incubateur.
Au bout de 10 jours en co-culture, récoltez les flacons du bioréacteur un à la fois et tirez toutes les cellules dans un paquet de transfert de taille appropriée. Après avoir retiré les échantillons de contrôle de la qualité, centrifuger les cellules à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Laver les cellules dans une solution de solution cristalloïde équilibrée, complétée par 0,5% de HSA à 200 à 500 fois G pendant 15 minutes à température ambiante.
Remettez-les en suspension dans un volume cible de 100 à 300 millilitres de solution cristalloïde équilibrée avec 0,5% de HSA. Les cellules se sont séparées de la fraction de centrifugation post-contre-courant. Deux ont donné une population de lymphocytes purs, avec une excellente viabilité moyenne de 95,80% L’expansion spécifique des lymphocytes T Gamma-Delta, avec l’acide zolédronique dépendait du pourcentage initial de cellules tueuses naturelles présentes dans la fraction lymphocytaire après élutriation.
L’enrichissement de la substance médicamenteuse à cellules T Gamma-Delta, avec épuisement alpha bêta des récepteurs des lymphocytes T, était cohérent. Le médicament Gamma-Delta T-cell fabriqué à partir de trois donneurs sains répondait au critère de libération de moins de 1 % des lymphocytes T alpha bêta positifs du récepteur des lymphocytes T, avec une moyenne de 0,11 % de lymphocytes B CD20 positifs et de 0,00 % de lymphocytes T alpha bêta positifs. Le pourcentage moyen de cellules tueuses naturelles dans le produit final était d’environ 17,06%, ce qui répondait au critère de libération de moins de 35% de coloration de la surface cellulaire et d’analyse cytométrique en flux, ont été utilisés pour caractériser l’identité, la pureté et les impuretés de processus de la substance médicamenteuse et du produit pharmaceutique.
La deuxième réextension obtenue à partir de la co-culture de la substance médicamenteuse à cellules T AAPC et Gamma-Delta a généré un produit médicamenteux à cellules T Gamma-Delta qui répondait à tous les critères de libération. Les pathons qui enrichissent la population de lymphocytes T ont un impact sur l’expansion et les caractéristiques du produit. Il est nécessaire d’examiner et d’étudier suffisamment les méthodes d’enrichissement avant le lancement de leur processus d’enrichissement.
