AirID est une enzyme précieuse pour l’interaction protéine-protéine, et il crée moins de toxicité et moins d’erreurs dans les processus chronométrés que d’autres enzymes de marquage de proximité. Un protocole étape par étape est présenté pour réaliser l’expérience de marquage de proximité chez le concombre ou Cucumis sativus en utilisant AT4G18020 protéine APRR2-AirID comme modèle. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng et Min Zhang de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.
Commencez par transférer les graines de Cucumis sativus ou de concombre dans l’eau, incubez-les à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis placez les graines sur le papier filtre sur une plaque de Pétri pendant 12 à 16 heures. Plus tard, transférez les graines dans des pots contenant de la terre et cultivez-les dans une chambre climatique à 23 degrés Celsius en 16 heures de lumière et 18 heures d’obscurité pendant trois à quatre semaines. Transférer 2,5 microlitres du plasmide EarleyGate 100 aux cellules compétentes de la souche GV3101 d’agrobacterium tumefaciens.
Incubez le tube sur de la glace pendant 30 minutes avant de le transférer à l’azote liquide pendant trois minutes. Pour donner le choc thermique, transférez le tube dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez ensuite le tube sur de la glace pendant deux minutes.
Ajouter 1 000 microlitres de Luria Bertani ou de milieu LB aux cellules d’agrobactéries choquées par la chaleur. Après avoir incubé les cellules à 30 degrés Celsius et 118 tr/min pendant une heure, centrifugez-les à 3000 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant de 800 microlitres et mélangez le reste de la solution.
Posez-le sur le milieu LB complété par 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et de gentamycine chacun et 25 microgrammes par millilitre de rifampicine. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Ramassez quelques colonies bactériennes dans les assiettes.
Mettez-les dans un milieu liquide LB, complété par des antibiotiques appropriés et incubez le LB liquide à 30 degrés Celsius et 218 tr/min pendant 36 à 48 heures. Après deux minutes de centrifugation à 3 000 G à quatre degrés Celsius, remettre la pastille en suspension dans un tampon d’agro-infiltration pour ajuster la densité optique à une à la longueur d’onde de 600 nanomètres. À l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre, infiltrer tout l’épiderme de la surface abaxiale avec 1,5 millilitre d’inoculum agrobactérien remis en suspension.
Maintenez les plantes dans la chambre climatique à 23 degrés Celsius avec 75 micromoles par mètre carré par seconde de lumière pendant 16 heures dans des conditions d’obscurité pendant huit heures Après 36 heures, infiltrez un millilitre de cinq microgrammes de biotine dans les feuilles déjà filtrées. Après quatre à 12 heures d’infiltration de biotine, coupez les feuilles et transférez-les rapidement à l’azote liquide pour éviter la dégradation des protéines. Broyez les feuilles à l’aide d’un pilon et d’un mortier et ajoutez rapidement deux millilitres de PBS BSA de pH 7,4, suivi d’un broyage lent.
Transférez le mélange d’échantillons dans un tube conique de 15 millilitres à travers un filtre à matériau de filtration rapide placé sur le dessus et gardez le tube sur de la glace. Transférez les échantillons dans un tube de deux millilitres. Ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de protéines à 1 % et mélangez le contenu en tournant le tube de haut en bas sept à huit fois avant de le centrifuger.
Une fois cela fait, transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres et ajoutez 10% de bêta-D-maltoside. Placez le tube sur de la glace pendant cinq minutes avant de centrifuger à 20 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour équilibrer la colonne de dessalage, marquez un côté de la colonne et centrifugez-la avec le côté marqué vers l’extérieur.
Retirez les couvercles supérieur et inférieur de la colonne et centrifugez à nouveau à 1 000 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez la solution liquide du tube de collecte de la colonne et lavez le tube avec cinq millilitres de tampon PBS avec centrifugation comme démontré précédemment, au moins cinq fois. Ajoutez un millilitre de PBS BSA à 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1 dans un tube de 1,5 millilitre et mélangez bien.
Placez le tube sur un support magnétique pendant trois minutes pour absorber les billes vers un côté du tube. Jetez le surnageant de l’autre côté et répétez ce lavage PBS BSA trois fois. Pour enrichir la protéine biotinylée, ajoutez deux millilitres d’échantillons dans la colonne.
Après centrifugation de la colonne à 1000 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez un millilitre d’extrait de protéine dessalée à 50 microlitres de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine-C1. Mélangez bien la solution en plaçant le tube contenant les billes magnétiques sur le rotateur à vitesse normale et à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, placez les billes sur la grille magnétique pendant trois minutes à température ambiante ou jusqu’à ce qu’elles se rassemblent d’un côté du tube.
Retirez délicatement le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon de lavage. Faites tourner le tube pendant deux minutes sur un rotateur et répétez l’étape effectuée sur la grille magnétique pour retirer le surnageant. De même, effectuez les lavages avec un millilitre de tampons de lavage deux et trois comme démontré précédemment.
Ensuite, retirez le détergent dans les tampons de lavage en ajoutant 1,7 millilitre de chlorhydrate de tris à 50 millimolaires et en répétant l’étape effectuée sur la grille magnétique. Donnez six lavages de deux minutes chacun en utilisant un millilitre de tampon de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires. Une fois cela fait, ajoutez 50 microlitres d’extrait protéique contenant 50 millimolaires de chlorhydrate de tris, 12 % de saccharose, 2 % de laurylsulfate de lithium et 1,5 % de dithiothréitol aux billes, et placez le tube dans l’incubateur à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes pour donner un choc thermique.
Après avoir répété l’étape sur une grille magnétique, stockez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse LCMS/MS. L’analyse par transfert Western des protéines extraites a montré une expression protéique et une biotinylation réussies dans les feuilles de concombre infiltrées. Le niveau d’expression plus élevé des protéines marquées et des bandes supplémentaires par rapport au témoin a confirmé le marquage réussi des protéines cibles du gène d’intérêt par AirID.
Les résultats ont été confirmés à l’aide d’anticorps anti-drapeau et anti-masse montrant la bande cible avec un anticorps anti-drapeau dans tous les échantillons transformés. Après avoir enrichi des protéines biotinylées avec des billes magnétiques conjuguées à la streptavidine-C1, plusieurs protéines de tailles différentes ont été observées. De tous les résultats, il a été conclu qu’AirID est une enzyme nouvelle et idéale pour analyser les interactions protéine-protéine chez les plantes.
Lors de l’expérience de marquage de proximité, il est important de se rappeler que la biotine à cinq micromolaires et la durée HR sont idéales. Le protocole décrit la configuration étape par étape du marquage de proximité basé sur AirID dans la plante, y compris la préparation de l’échantillon de feuilles, l’élimination de la pré-biotine, la quantification des protéines d’extrait et l’enrichissement des protéines biotinylées. AirID devrait améliorer la précision de la biotinylation indépendante de l’IPP en combinaison.
Il est conclu qu’AirID est idéal pour l’analyse des IPP dans les plantes.
