Nous remercions les Drs. Steve Mount et Zhang Xiaoning pour le 35S:: GFP pGlowbug construire et l&#39;Hokensen Bourse de doctorat au CH de recherche dans le laboratoire de Z. L&#39;s est soutenue par le US National Science Foundation (IOB0616096 et MCB0744752). ZL est partiellement pris en charge par l&#39;Université du Maryland de la station expérimentale agricole.

I. préparation de plasmide L&#39;ADN plasmidique utilisé pour le bombardement doit être de haute pureté et à une concentration de 500ng/μl ou supérieure. Pour BiFC impliquant deux constructions plasmidiques, 25 pg de chaque plasmide est nécessaire. En d&#39;autres termes, rapport molaire 1:1 des deux plasmides doivent être mélangés pour donner naissance à 50 pg d&#39;ADN plasmidique total pour la préparation des cartouches. Soyez conscient que l&#39;ajout de plus d&#39;ADN de 50 mg peut provoquer une agglomération des particules d&#39;or et devrait être évitée. Disponibles dans le commerce des kits d&#39;extraction d&#39;ADN plasmidique sont recommandés pour les isoler des ADN plasmidiques. Les vecteurs plasmidiques devraient être relativement de petite taille tels que pUC19. Nous avons cloné SEU et LUH ADNc dans pUC19-SPYNE et pUC19-SPYCE, respectivement 3. Vecteurs binaires pour transformation par Agrobacterium sont trop grosses et inadaptées pour le bombardement. II. Cartouche préparation Préparation des cartouches implique des particules d&#39;or revêtement avec l&#39;ADN plasmidique et leur chargement dans le tuyau en plastique qui est ensuite découpé en morceaux moitié pouce de long, qui peut être chargé dans la cartouche porteurs du gène pistolet. Préparation des cartouches est décrit en détail une grande dans un article séparé Jove 4 et n&#39;est donc pas décrite ici. Pour le bombardement de cellules d&#39;oignon, nous vous recommandons de mélanger 50 ug d&#39;ADN plasmidique avec 12,5 mg de particules d&#39;or par la préparation, ce qui donne environ jusqu&#39;à 50 cartouches à 1 ug DNA/0.25 mg d&#39;or / cartouche. Chaque cartouche est d&#39;un seul coup. Les particules d&#39;or peut être soit 0,6 um ou 1,0 m de diamètre (Cat # 1652262 # 1652263 ou Cat; Biorad). Nous recommandons aussi d&#39;utiliser 0,5 mg / ml solution PVP pour la préparation des cartouches. Pour BiFC, combiner les deux ADN plasmidique de chaque partenaire d&#39;interaction putative dans la préparation même cartouche. Après une préparation cartouche, il est important de tester les cartouches en tirant des cartouches nouvellement faite à une pression d&#39;hélium entre 150 à 200 psi dans un Parafilm carré qui est enroulé autour d&#39;une boîte de Pétri. Ce sera de tester si les particules d&#39;or peut être propulsé de manière efficace à partir des cartouches, vous devriez voir les particules d&#39;or pâle sur le Parafilm. Cela vous donne une idée de la zone qui couvrira chaque tir. Vous remarquerez peut-être différentes quantités de particules d&#39;or propulsé sur la Parafilm à différentes pressions d&#39;hélium (à 150-200 gamme de psi). S&#39;il n&#39;y a pas de différence significative, choisissez la basse pression pour le bombardement. III. Préparation des tissus d&#39;oignon Le jour du tournage, décollez la peau extérieure d&#39;un gros oignon jaune. En utilisant une lame de rasoir propre et bien aiguisé, couper 4-5 couches profondes d&#39;une zone rectangulaire d&#39;environ 2 x 8 cm. Sortez le tissu rectangulaires oignons, jetez les deux couches extérieures, couper les autres couches de l&#39;oignon en morceaux environ 2x1.5 cm. Placez les morceaux d&#39;oignon dans une boîte de Petri contenant du papier filtre (papier Whatman 3MM couper en cercles) humidifié avec de l&#39;eau stérile. Couvrir le plat de Pétri et ils sont prêts à aller. IV. Bombardement <ol><li> Charger les cartouches dans le porte cartouche ronde blanche. Cartouches contenant différentes constructions plasmidiques doivent être chargés en porte-cartouches différentes. Chaque support de la cartouche peut contenir jusqu&#39;à 12 cartouches pour 12 tirs. </li><li> Insérez la batterie et la doublure baril frais dans le pistolet à gènes Helios. Assurez-vous que le liner baril et le pistolet ont respectifs joints toriques joints. </li><li> D&#39;abord, insérez un support cartouche vide dans le canon à gènes, avec la marque N ° 12 sur le support de la cartouche vers le sommet de l&#39;arme. Support de la cartouche d&#39;avance une ou deux fois pour s&#39;assurer qu&#39;elle est insérée correctement. </li><li> Fixez pistolet au réservoir d&#39;hélium et d&#39;ajuster la pression entre 150 à 200 psi. </li><li> Porter une protection auditive et le pistolet feu à quelques reprises avec le support de la cartouche vide pour nettoyer la chambre de l&#39;arme et de s&#39;assurer que la pression est stable. </li><li> Retirez le support de la cartouche vide et insérer un support de la cartouche chargée. Faire progresser le support de la cartouche de sorte que la cartouche que vous voulez le feu est placé au fond (06 heures) du support de la cartouche. Tir d&#39;un morceau d&#39;oignon ici fournit une forme de contrôle négatif pour la fluorescence de fond. </li><li> Placez les morceaux d&#39;oignon au milieu d&#39;un plat vide Petri avec la couche la plus interne de l&#39;oignon vers le haut. Reste paquebot le baril du pistolet gène sur boîte de Pétri et le feu au pistolet en appuyant sur le bouton latéral tout en tirant sur la gâchette. Transférer les oignons bombardé à une boîte de Petri contenant humides papier 3MM filtre. </li><li> Avance à la cartouche suivante et le feu un morceau d&#39;oignon différent. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce que quatre à cinq morceaux d&#39;oignons sont fusillés. Chaque morceau d&#39;oignon est tiré une fois. </li><li> Changer pour un support de cartouche différents chargé avec des cartouches contenant une combinaison de différents plasmides ou différents plasmides. N&#39;oubliez pas de changer le liner le baril unes bien pour empêcher la contamination. Tirez sur quatre à cinq morceaux d&#39;oignon. </li><li> Après le bombardement, retourner toutes les oignons aux plats perti. Couvrir les boîtes de Pétri avec des couvercles. Enveloppez-les avec du Parafilm pour éviter le dessèchement. Incuber les morceaux d&#39;oignon à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 16 à 48 heures. </li><li> Éteignez la pression du gaz et de libération avant de détacher le pistolet à gènes à partir du réservoir d&#39;hélium. Dévissez la doublure baril, et retirez le support de la cartouche et les cartouches utilisées (ou non). </li><li> Nettoyage porte-cartouches et les doublures baril en les submergeant dans un bécher avec de l&#39;eau savonneuse. Placer le bécher dans un bain d&#39;ultrasons et soniquer pendant 20 minutes. Ensuite, les rincer à l&#39;eau pour enlever tous les résidus de savon. Faites-les tremper dans de l&#39;éthanol à 70% pour une heure, puis les sécher sur du papier absorbant. </li></ol> V. Observation <ol><li> Après une incubation morceaux d&#39;oignon bombardé pendant 16-20 heures à température ambiante, on peut observer la GFP ou YFP fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence comme le Zeiss Axio Observer.z1 utilisées dans cette étude. </li><li> Utilisez une pince à bouts plats lentement peler une couche de cellule unique hors de l&#39;épiderme interne de l&#39;oignon (la couche qui donne directement sur le pistolet pendant le bombardement). Placez le zeste sur une goutte d&#39;eau sur une diapositive. Ajouter lamelle mais attention à minimiser les bulles. </li><li> Sous champ lumineux du microscope, vérifiez d&#39;abord pour le streaming cytoplasmique de s&#39;assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire, exposer la diapositive à la lumière brillante de terrain pendant quelques minutes pour réchauffer le tissu oignon et ensuite chercher plastes mouvement. Le streaming cytoplasmique n&#39;est pas toujours facile à voir, donc ne vous découragez pas si vous ne pouvez pas voir toute. </li><li> Pour la détection de fluorescence, l&#39;utilisation d&#39;excitation appropriée et des filtres de détection de la GFP ou YFP. Il est important d&#39;inclure des contrôles négatifs, comme les morceaux d&#39;oignon tourné avec un plasmide non fluorescent. Faint signaux jaune peut apparaître à partir des cellules blessés, des bulles d&#39;air, ou de débris. Il est également important d&#39;inclure des contrôles positifs. Un plasmide contenant journaliste exprimée de façon constitutive fluorescents tels que 35S:: GFP est un excellent contrôle positif. Signaux GFP visibles à partir des cellules épidermiques d&#39;oignon (figure 1A, D) a indiqué que les cartouches, les tissus d&#39;oignon, et le tir au canon de gènes sont bien préparés et exécutés. Par la suite, nous avons observé les interactions entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE en morceaux l&#39;oignon bombardés avec des cartouches contenant un mélange de 35S:: SEU-pSPYNE et 35S:: LUH-pSPYCE ADN. Faint fluorescence YFP a été observée dans le noyau uniquement (figure 1 B, E), indiquant l&#39;interaction physique directe entre SEU et LUH qui a amené les fragments YFP diviser ensemble dans le noyau. Notez que le signal de la YFP BiFC est significativement plus faible que le signal GFP du 35S:: GFP. </li></ol> Les résultats représentatifs Dans notre étude rapportée ici, le 35S:: contrôle positif GFP plasmide dégage une forte fluorescence qui remplit toute la cellule, y compris à la fois le noyau et le cytoplasme (figure 1A, D). Protéine GFP est assez petit pour se diffuser dans le noyau sans un signal de localisation nucléaire. En revanche, SEU et LUH sont deux facteurs de transcription chez Arabidopsis déjà montré à interagir dans un double-hybride en levure de test 2. Seu-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et LUH-pSPYCE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP), à la fois trop grand pour diffuser dans le noyau, contenant des signaux de localisation nucléaire de 2,5. Le signal de fluorescence détecté YFP dans le noyau de la cellule d&#39;oignon (figure 1 B, E) indique que SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE peuvent interagir dans les noyaux d&#39;oignon. Aucun signal fluorescent est détecté dans les oignons bombardés avec un mélange plasmide de pSPYNE vecteur plasmidique contenant le fragment N-terminal de la YFP et Luh-pSPYCE (figure 1C, F). La fluorescence BiFC médiée YFP est significativement plus faible que la fluorescence de la GFP-médiatisée de la 35S:: GFP plasmide. Dans notre étude, ils ont également montré différentes localisation subcellulaire (comparer avec la figure 1A B). De plus, le nombre de cellules fluorescentes est significativement plus faible pour BiFC, comme BiFC ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires réussir à entrer et sont exprimés dans les cellules d&#39;oignon mêmes. <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Fluorescent (A, B, C) ​​et le champ lumineux (D, E, F) des images de cellules d&#39;oignon bombardés avec différentes constructions plasmidiques. (A) et (D), des cellules d&#39;oignon bombardés par 35S:: GFP. GFP se diffuse à travers le cytoplasme et le noyau. (B) et (E), des cellules d&#39;oignon bombardés par l&#39;égalité de mélange molaire de 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusionné au fragment C-terminal ) d&#39;ADN plasmidique. Une interaction entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE est représenté par un noyau fluorescent. (C) et (F), un contrôle négatif montrant des cellules d&#39;oignon bombardés avec des mélanges de vecteur pUC19-SPYNE et LUH-pSPYCE plasmiDS. Aucun signal fluorescent est détecté.

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

<ol><li> Pour les utilisateurs de première fois, nous vous recommandons de pratiquer toute la procédure, de la préparation Cartouche d&#39;observation, avec un seul reporter constitutive plasmide tel que 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Nous avons utilisé un 35S:: plasmide GFP obtenu de MM. Steve Mount et Zhang Xiaoning 6 (figure 1A, D). Les cartouches gène tiré de contrôle vendus à RioRad (Cat 165-2244) ne sont pas appropriées pour les plantes. </li><li> Pour BiFC, un deuxième contrôle positif est nécessaire, ce qui devrait se co...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

Enquête sur la fonction des gènes dans des organismes variés s&#39;appuie sur la connaissance de la façon dont les produits des gènes interagissent les uns avec les autres dans leur environnement cellulaire normal. La complémentation bimoléculaire fluorescence (BiFC) Assay<sup&gt; 1</sup&gt; Permet aux chercheurs de visualiser les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et est devenu un outil de recherche indispensable. Ce dosage est basé sur l&#39;association facilitée de deux fragments d&#39;une protéine fluorescente (GFP) qui sont chacun fusionné à une protéine interagissant partenaires potentiels. L&#39;interaction des deux protéines partenaires serait de faciliter l&#39;association de la N-terminal et fragment C-terminal de la GFP, conduisant à la fluorescence. Pour les chercheurs cellules végétales, oignons épidermiques sont un système idéal d&#39;expérimentation pour la réalisation du dosage BiFC raison de la facilité à obtenir et à préparer les tissus oignon et la visualisation directe de la fluorescence avec la fluorescence de fond minimal. Le pistolet à gènes Helios (BioRad) est couramment utilisé pour bombarder l&#39;ADN plasmidique dans les cellules d&#39;oignon. Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;Hélios pistolet à gènes à introduire constructions plasmidiques pour deux interagissant<em&gt; Arabidopsis thaliana</emFacteurs de transcription&gt;, Seuss (UFE) et HOMOLOGUE LEUNIG (LUH)<sup&gt; 2</sup&gt; Et la visualisation de leurs interactions médiées par les cellules d&#39;oignon BiFC épidermique.

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Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Cet article illustre comment utiliser correctement l&#39;Helios BioRad Gene Gun pour introduire l&#39;ADN plasmidique dans les cellules de l&#39;épiderme et l&#39;oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l&#39;oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K vues.  University of Maryland. Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)

Vidéo: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun transfection de neurones de l&#39;hippocampe

Recherche

Biologie

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...