Ce protocole permet une détermination précise de la durée de la phase S dans les cellules de levure bourgeonnantes synchronisées. C’est une méthode rapide, facile et reproductible. De plus, il est suffisamment sensible pour détecter de légers défauts de synthèse non détectés par les protocoles classiques.
Cette méthode sera utile à de nombreux chercheurs travaillant sur la régulation du cycle cellulaire chez la levure bourgeonnante. Nicolas Talarek, chercheur senior, et Juan De Dios Barba Tena, doctorant au laboratoire, feront la démonstration de ce protocole. Inoculer des cellules de Saccharomyces cerevisiae dans 10 millilitres de milieu SC à une faible concentration cellulaire pour une culture nocturne à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale à 130 rotations par minute.
Le lendemain, diluer les cellules dans 20 millilitres de milieu SC frais à une concentration finale de deux à trois fois 10 à six cellules par millilitre. À 40 microlitres d’un milligramme par millilitre de facteur alpha dilué dans de l’eau. Ensuite, cultivez les cellules à 30 degrés Celsius, avec une agitation orbitale à 130 rotations par minute pendant une heure.
Répétez cette étape une fois. Visualisez les cellules au microscope optique pour surveiller l’arrêt G1. Continuez si plus de 90% des cellules présentent un shmoo et que les autres sont des cellules arrondies non boutées.
Centrifuger les échantillons pendant trois minutes à 1 500 G.Jeter ensuite le surnageant avec la pipette à vide et remettre les cellules en suspension dans 20 millilitres de milieu SC. Répétez cette étape une fois. Collectez un millilitre de cellules deux fois toutes les cinq minutes et procédez à l’étiquetage EDU.
Ajouter 400 microlitres du facteur alpha 30 minutes après la libération. Transférer un millilitre de la culture cellulaire dans un tube à microfuge de deux millilitres contenant un microlitre d’UDE 10 millimolaires, bien mélangé par inversion. Pour distinguer les cellules EDU positives des cellules EDU négatives sur un bivariant Pi EDU, transférez un autre millilitre de culture cellulaire dans un tube de microfuge de deux millilitres contenant un microlitre de DMSO.
Incuber pendant trois à cinq minutes à 30 degrés Celsius sous agitation dans un bain-marie agité. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d’éthanol à 100%. Enduire les cellules pendant deux minutes à 10 000 G dans un microfuge.
Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette à vide. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres d’éthanol à 70% et mélangez bien par vortex. Laisser les échantillons à température ambiante pendant au moins une heure à 20 inclinaisons par minute sur une bascule à vitesse variable pour perméabiliser les cellules.
Enduire les cellules pendant deux minutes à 10 000 G dans une microcentrifugeuse et jeter le surnageant avec une pipette à vide. Lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres d’éthanol à 10% et de PBS. Enduire les cellules pendant deux minutes à 10 000 G dans un microfuge et jeter le surnageant avec une pipette à vide.
Remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS contenant de la RNase A et de la protéinase K.Incuber d’une à deux heures à 50 degrés Celsius avec agitation occasionnelle, ou toute la nuit à 37 degrés Celsius. Enduire les cellules pendant deux minutes à 10 000 G dans une microcentrifugeuse et jeter le surnageant avec une pipette à vide. Lavez les cellules avec 500 microlitres de PBS.
Ensuite, les cellules et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de PBS avec 1% de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Ensuite, pelletez les cellules, jetez le surnageant comme démontré précédemment, et remettez en suspension la pastille dans 300 microlitres de PBS contenant 1% BSA. Répartir les cellules dans deux tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre. Le premier devrait être composé de 200 microlitres de culture cellulaire pour la réaction de clic, et le second tube devrait contenir 100 microlitres de culture cellulaire pour la coloration verte sytox.
Ensuite, pelletez les cellules et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Pour la coloration verte sytox, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de PBS. Ensuite, en fonction de la concentration cellulaire, transférer 10 à 30 microlitres dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 microlitres de mélange vert sytox.
Soniquer les échantillons deux fois pendant deux secondes à une amplitude de 40 à 50%Laisser dans l’obscurité jusqu’à ce que les échantillons soient traités sur un cytomètre en flux. Pour la réaction de clic, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 40 microlitres de tampon de colorant azotural fraîchement préparé. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 60 minutes.
Enduisez les cellules en granulés et jetez le surnageant comme démontré précédemment. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 300 microlitres d’éthanol à 10% dans du PBS. Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de 50 microgrammes par millilitre d’iodure de propidium dans du PBS et laissez reposer 10 minutes dans l’obscurité.
Selon la concentration cellulaire, transférer 10 à 30 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube de cytomètre en flux contenant 300 microlitres de Tris HCl 50 millimolaires, pH 7,5. Soniquer deux fois pendant deux secondes à une amplitude de 40 à 50. Laissez les échantillons dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient traités sur un cytomètre.
Lisez les échantillons sytox green à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nanomètres et d’un filtre passe-bande de 530 par 30. Lisez les échantillons Bavaria Pi EDU sur un diagramme de points à l’aide d’un laser bleu d’excitation à 488 nanomètres et d’un filtre passe-bande de 615 x 20 pour l’axe X Pi, et d’un laser d’excitation rouge à 640 nanomètres, d’un filtre passe-bande de 660 x 20 pour l’axe Y. Trois populations de cellules ont été observées dans l’analyse bivariante du cytomètre EDU Pi.
À 25 degrés Celsius, environ 27% de la population cellulaire était en phase G1, 29% en phase S et environ 44% en phase G2 plus M. Dans les cellules synchronisées, la durée de la phase S peut être d’environ 25 minutes en fonction du moment où la teneur en ADN est passée d’un C à deux C sur le profil du cytomètre en flux vert sytox. L’étiquetage des impulsions EDU a déterminé avec précision la durée de la phase S.
15 minutes après la libération, une fraction de cellules EDU positives a été détectée, indiquant le début de la phase S. La progression à travers la phase S a été vue par le nuage cellulaire se déplaçant vers le haut et vers la droite dans le graphique EDU Bavaria Pi. Enfin, à 35 minutes de la libération, une fraction des cellules était EDU négative, mais avec deux fois plus d’ADN indiquant que la phase S s’est terminée et que les cellules étaient dans la phase G2 plus M.
Malgré la forte synchronie observée, certaines cellules ont terminé la phase S 60 minutes après la libération et la phase S était complète pour l’ensemble de la population environ 65 minutes après la libération. Il est crucial d’avoir une synchronisation parfaite et d’empêcher les cellules d’entrer dans la deuxième phase S. Les cellules peuvent être imagées avec un microscope où la prévision de la réplication de l’ADN nucléaire peut être surveillée et quantifiée.
Cette technique aidera à identifier les mutants négligés qui présentent de légers défauts de phase S, ainsi que des défauts de durée du cycle cellulaire.
