Questo protocollo consente una determinazione precisa della durata della fase S in cellule di lievito in erba sincronizzate. È un metodo rapido, facile e riproducibile. Inoltre, è abbastanza sensibile da rilevare lievi difetti di sintesi non rilevati dai protocolli classici.
Questo metodo sarà utile per molti ricercatori che lavorano sulla regolazione del ciclo cellulare nel lievito in erba. A dimostrare questo protocollo saranno Nicolas Talarek, un ricercatore senior, e Juan De Dios Barba Tena, uno studente di dottorato in laboratorio. Inoculare le cellule di Saccharomyces cerevisiae in 10 millilitri di terreno SC a bassa concentrazione cellulare per una coltura notturna a 30 gradi Celsius con agitazione orbitale a 130 rotazioni al minuto.
Il giorno seguente, diluire le cellule in 20 millilitri di mezzo SC fresco ad una concentrazione finale di due o tre volte 10 alle sei cellule per millilitro. A 40 microlitri di un milligrammo per millilitro di fattore alfa diluito in acqua. Quindi coltivare le cellule a 30 gradi Celsius, con agitazione orbitale a 130 rotazioni al minuto per un'ora.
Ripetere questo passaggio una volta. Visualizza le cellule al microscopio ottico per monitorare l'arresto G1. Procedere se più del 90% delle celle mostra uno shmoo e le altre sono celle arrotondate non buttate.
Centrifugare i campioni per tre minuti a 1.500 G.Quindi scartare il surnatante con la pipetta a vuoto e risospendere le cellule in 20 millilitri di mezzo SC. Ripetere questo passaggio una volta. Raccogliere un millilitro di cellule due volte ogni cinque minuti e procedere all'etichettatura EDU.
Aggiungere 400 microlitri del fattore alfa 30 minuti dopo il rilascio. Trasferire un millilitro di coltura cellulare in un tubo microfuge da due millilitri contenente un microlitro di 10 millimolari EDU, mescolato bene per inversione. Per discriminare le cellule EDU positive dalle cellule EDU negative su un fatto bivariante Pi EDU, trasferire un altro millilitro di coltura cellulare in un tubo microfuge da due millilitri contenente un microlitro di DMSO.
Incubare per tre-cinque minuti a 30 gradi Celsius sotto agitazione in un bagno d'acqua agitante. Interrompere la reazione aggiungendo 100 microlitri di etanolo al 100%. Pellettare le cellule per due minuti a 10.000 G in un microfuge.
Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta a vuoto. Risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di etanolo al 70% e mescolare bene a vortice. Lasciare i campioni a temperatura ambiente per almeno un'ora a 20 inclinazioni al minuto su un bilanciere a velocità variabile per permeare le cellule.
Pellettare le cellule per due minuti a 10.000 G in una microcentrifuga e scartare il surnatante con una pipetta sottovuoto. Lavare le celle due volte con 500 microlitri di etanolo al 10% e PBS. Pellettare le cellule per due minuti a 10.000 G in un microfuge e scartare il surnatante con una pipetta sottovuoto.
Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS contenente RNasi A e proteinasi K.Incubare da una a due ore a 50 gradi Celsius con agitazione occasionale, o durante la notte a 37 gradi Celsius. Pellettare le celle per due minuti a 10.000 G in una microcentrifuga e scartare il surnatante con una pipetta sottovuoto. Lavare le celle con 500 microlitri di PBS.
Quindi pellettare le cellule e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS con 1% BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi pellettare le cellule, scartare il surnatante come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet in 300 microlitri di PBS contenente l'1% di BSA. Distribuire le cellule in due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Il primo dovrebbe consistere in 200 microlitri di coltura cellulare per la reazione Click e il secondo tubo dovrebbe contenere 100 microlitri di coltura cellulare per la colorazione verde sytox.
Quindi, pellet le cellule e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Per la colorazione verde sytox, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di PBS. Quindi, a seconda della concentrazione cellulare, trasferire da 10 a 30 microlitri in un tubo citometrico a flusso contenente 300 microlitri di miscela verde di sytox.
Sonicare i campioni due volte per due secondi a un'ampiezza compresa tra 40 e 50%Lasciare al buio fino all'elaborazione dei campioni su un citometro a flusso. Per la reazione Click, risospendere il pellet cellulare con 40 microlitri di tampone colorante Azide appena preparato. Incubare a temperatura ambiente al buio per 60 minuti.
Pellet le cellule e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Quindi lavare le celle tre volte con 300 microlitri di etanolo al 10% in PBS. Quindi risospendere le cellule in 100 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio in PBS e lasciare per 10 minuti al buio.
A seconda della concentrazione cellulare, trasferire da 10 a 30 microlitri della sospensione cellulare in un tubo citometrico a flusso contenente 300 microlitri di Tris HCl da 50 millimolari, pH 7,5. Sonica due volte per due secondi con un'ampiezza compresa tra 40 e 50. Lasciare i campioni al buio fino a quando non li elabora su un citometro.
Leggi i campioni verdi sytox usando un laser blu di eccitazione a 488 nanometri e un filtro passa banda 530 per 30. Leggi i campioni EDU Bavaria Pi su un dot plot usando un laser blu di eccitazione a 488 nanometri e un filtro passa banda 615 per 20 per l'asse X Pi e un laser di eccitazione rosso a 640 nanometri, un filtro passa banda 660 per 20 per l'asse Y. Tre popolazioni di cellule sono state osservate nell'analisi del citometro bivariante EDU Pi.
A 25 gradi Celsius, circa il 27% della popolazione cellulare era nella fase G1, il 29% era nella fase S e circa il 44% era nella fase G2 più M. Nelle cellule sincronizzate, la durata della fase S può essere di circa 25 minuti in base al momento in cui il contenuto di DNA è cambiato da una C a due C sul profilo citometrico a flusso verde sytox. L'etichettatura a impulsi EDU ha determinato con precisione la durata della fase S.
15 minuti dopo il rilascio, è stata rilevata una frazione di cellule EDU positive, indicando l'inizio della fase S. La progressione attraverso la fase S è stata osservata dalla nube cellulare che si muove verso l'alto e verso destra nel grafico Bavaria Pi EDU. Infine, a 35 minuti dal rilascio, una frazione di cellule era EDU negativa, ma con il doppio della quantità di DNA che indicava che la fase S era terminata e le cellule erano nella fase G2 più M.
Nonostante l'elevata sincronia osservata, alcune cellule hanno terminato la fase S 60 minuti dopo il rilascio e la fase S è stata completata per l'intera popolazione circa 65 minuti dopo il rilascio. È fondamentale avere una perfetta sincronizzazione e impedire alle cellule di entrare nella seconda fase S. Le cellule possono essere visualizzate con un microscopio in cui è possibile monitorare e quantificare la previsione della replicazione del DNA nucleare.
Questa tecnica aiuterà a identificare i mutanti trascurati che hanno lievi difetti di fase S, così come difetti di durata del ciclo cellulare.
