Notre protocole fournit une méthode douce d’inoculation et d’extraction des plantes qui permet de récupérer les populations bactériennes cultivées dans l’apoplast foliaire adaptée à l’analyse de l’expression génique unicellulaire telle que la cytométrie en flux. Cette méthode permet d’extraire une quantité considérable de bactéries de l’apoplast sans contaminer de manière significative les échantillons avec des débris cellulaires végétaux. Cette méthode optimisée pour la récupération des bactéries apoplastiques peut être appliquée directement ou avec des modifications mineures à un certain nombre de systèmes bactériens végétaux comprenant soit des bactéries phytopathogènes, soit des bactéries endocytaires bénéfiques.
La démonstration de la procédure sera Nieves Lopez-Pagan, une doctorante de notre laboratoire. Pour commencer, remplissez un pot de 10 centimètres de diamètre avec un mélange de substrat végétal 1:3 de vermiculite préalablement arrosé. Couvrir le pot avec un treillis métallique perforé et ajuster le treillis métallique au sol humide à l’aide d’un élastique.
Ensuite, semez les graines d’Arabidopsis dans les trous du treillis métallique avec un cure-dent humide. Placez trois à quatre graines dans des positions éloignées dans le pot. Couvrir le pot avec un dôme en plastique pour maintenir une humidité relative élevée et incuber pour la stratification à quatre degrés Celsius pendant 72 heures.
Transférez le pot dans une chambre de croissance des plantes dans des conditions de journée courte. Pour découvrir le pot, retirez le dôme en plastique. Une fois les graines germées, utilisez la pince à épiler pour enlever la plupart des plants, en gardant un plant dans chacune des positions du pot.
Ensuite, préparez des plants de haricots Phaseolus vulgaris en recouvrant le fond d’une boîte de Petri avec un morceau de serviette en papier humide et en plaçant les graines de haricots dessus. Scellez la boîte de Petri avec du ruban chirurgical et incuber à 28 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Transférer les graines germées dans un pot de 10 centimètres de diamètre rempli d’un mélange humide de substrat de vermiculite 1:3 et incuber dans une chambre de croissance des plantes sous de longues journées.
Étaler le stock de glycérol de la souche d’intérêt de Pseudomonas syringae de moins 80 degrés Celsius dans une plaque LB complétée par les antibiotiques appropriés. Incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures. Grattez la biomasse bactérienne et remettez-la en suspension dans cinq millilitres de chlorure de magnésium 10 millimolaires.
Mesurez la densité optique à 600 nanomètres et ajustez-la à 0,1 en ajoutant du chlorure de magnésium de 10 millimolaires. Effectuer des dilutions en série dans du chlorure de magnésium de 10 millimolaires pour obtenir une concentration finale d’inoculum de cinq fois 10 à la cinquième UFC par millilitre. Ensuite, préparez 200 millilitres d’inoculum pour les plantes d’Arabidopsis et 50 millilitres pour les plants de haricots.
Avant l’inoculation, ajouter le tensioactif Silwet L-77 à une concentration finale de 0,02 % pour l’inoculation des haricots et de 0,01 % pour Arabidopsis. Pour l’infiltration d’Arabidopsis, placez deux bâtons de bois formant un X sur le pot et placez le pot face vers le bas sur une boîte de Petri de 14 centimètres de diamètre contenant 200 millilitres d’inoculum. Pour l’inoculation des feuilles de haricot, insérer les plantes et la solution d’inoculum dans une chambre à vide et introduire la feuille dans un tube centrifugeur conique de 50 millilitres contenant l’inoculum.
Donnez une impulsion de 500 millibars pendant 30 secondes pour infiltrer les feuilles. Égoutter l’excès de solution d’inoculum avec un morceau de papier et remettre les plans dans leur chambre de croissance correspondante. Quatre jours après l’inoculation, coupez soit la partie aérienne de la plante d’Arabidopsis, soit la feuille inoculée du haricot et placez-la dans une seringue de 20 millilitres sans aiguille.
Pour les feuilles de haricot, roulez la feuille sur elle-même, en laissant la face abaxiale vers l’extérieur. Ajouter suffisamment d’eau distillée pour couvrir le tissu. Ensuite, insérez le piston qui maintient la seringue en position verticale et retirez l’excès d’air et les bulles d’air à l’intérieur de la seringue en tapotant doucement le canon jusqu’à ce que tout l’air soit situé près de l’embout et, après avoir retiré l’air, couvrez l’extrémité du corps de la seringue avec un film de paraffine.
Maintenant, appuyez soigneusement sur le piston pour générer une pression positive jusqu’à ce que le tissu devienne plus foncé. Ensuite, tirez sur le piston pour générer une pression négative. Retirez le film de paraffine et le piston et recueillez le liquide contenant les bactéries extraites de l’apoplaste.
Pour une analyse unicellulaire, préparer une solution d’agarose à 1,5% dans de l’eau distillée. Une fois fondu, ajoutez suffisamment de volume pour remplir l’espace entre deux lames de microscopie placées côte à côte et placez une autre lame sur le dessus. Laissez-les conduire pendant 15 minutes et retirez soigneusement la glissière placée sur le dessus.
À l’aide d’une lame, couper le tampon d’agarose en morceaux de cinq millimètres sur cinq millimètres avant utilisation. En parallèle, centrifuger un millimètre de la bactérie extraite de l’apoplaste. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettez la pastille en suspension dans 20 microlitres d’eau pour concentrer les cellules.
Placez une goutte de deux microlitres des cellules concentrées sur un couvercle de 0,17 millimètre et couvrez la goutte avec un morceau de tampon d’agarose. Visualisez la préparation bactérienne au microscope confocal pour identifier les bactéries fluorescentes vertes à l’aide de lasers spécifiques. Identifiez toutes les bactéries à l’aide du champ clair et fusionnez les deux champs.
Pour effectuer une analyse par cytométrie en flux, prendre une partie aliquote des suspensions de bactéries extraites de l’apoplaste. Analysez à l’aide du cytomètre en flux et obtenez 100 000 événements. L’expression de la GFP hrpL est surveillée par fluorescence GFP.
Les graphiques à points montrent la distribution de l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport à la taille des cellules dans la population, tandis que les histogrammes montrent l’intensité de fluorescence de la GFP par rapport au nombre de cellules. Les pourcentages hrpL ON étaient plus élevés que les pourcentages correspondants de hrpL OFF. Les images de microscopie à fluorescence montrent des niveaux hétérogènes de GFP associés à l’expression de hrpL.
Les bactéries présentant une fluorescence faible ou nulle de GFP sont observées. Pour des résultats optimaux, soyez doux lors des étapes d’extraction des bactéries pour éviter d’endommager le tissu végétal et ainsi limiter la contamination par le contenu cellulaire végétal. Les échantillons de bactéries obtenus peuvent être utilisés à d’autres fins où la réduction de la contamination des plantes est un avantage, telles que les extractions d’acides nucléiques pour une analyse génomique bactérienne ou transcriptomique ultérieure.
