Salaires et soutien à la recherche ont été fournis par le Conseil de soja-Unis, et par des fonds d&#39;État et fédéraux affectés à la Ohio State University / Ohio recherche agricole et le Centre de Développement. Cette recherche a également été partiellement financé par une bourse du CONACYT, au Mexique, au PHMC. La mention de marques ou de produits exclusifs ne constitue pas une garantie de qualité ou du produit par l&#39;OSU / OARDC et n&#39;implique pas non plus l&#39;approbation à l&#39;exclusion des autres produits qui peuvent également être adaptés. Journal l&#39;article Pas de HCS 09-17.

La méthodologie suivante décrit un protocole pour l&#39;analyse de l&#39;image de l&#39;expression génique utilisant un système automatisé de l&#39;image de collecte. Pour faciliter l&#39;explication, l&#39;approche globale a été décomposé en quatre étapes: la préparation des semences 1), 2) l&#39;introduction du gène par bombardement de particules, 3) la collecte d&#39;images robotiques et d&#39;analyse d&#39;image 4). Bien que cette méthodologie générale peut être utilisée pour une large gamme de d&#39;autres applications, les jeux présents sur les protocoles sont basés sur l&#39;utilisation de la protéine verte (GFP) fluorescentes gène, qui est un gène rapporteur utiles pour l&#39;expression du gène de suivi dans la même pièce des tissus vivants dans le temps. Préparation semences I. <ol><li> Haricot de Lima (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) les graines peuvent être achetées ou, idéalement récolté à partir de plantes cultivées dans une chambre de croissance (50% d&#39;humidité relative, 16 / 8 h de lumière: obscurité, 25/23 ° C jour / nuit). La qualité des semences après la récolte peut être maintenu par des graines de stockage à -20 ° C. </li><li> Préparer Magenta GA7 conteneurs pour faire germer les graines. Pliez le papier filtre ou de serviettes en papier pour entrer dans le fond des boîtes Magenta. Ajouter ~ 25 ml d&#39;eau déminéralisée pour chaque conteneur pour humidifier des serviettes en papier, et versez de l&#39;eau non absorbée off. Autoclave papier humidifié contenant les boîtes pendant 20 min. </li><li> En utilisant 50 ml microtubes jetables, stériliser les graines dans une solution de javel commerciale à 10% (20 graines de 20-40 ml) pendant 20 min avec agitation sur un agitateur giratoire à 60 rpm. Remarque: Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire. </li><li> Rincer les graines 4-7 fois à l&#39;eau déminéralisée stérile avec agitation douce pendant 30 sec lors de chaque rinçage. </li><li> Placer 5-6 graines stériles entre les couches de papier plié situé dans chaque boîte Magenta stérile. </li><li> Incuber les graines pendant 4 jours dans les conditions suivantes: 25 ° C, 16 / 8 h de lumière: obscurité et 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. L&#39;introduction du gène par bombardement de particules <ol><li> Construire des constructions de gènes en utilisant votre vecteur d&#39;expression favori avec un gène rapporteur qui peuvent être surveillés dans les tissus vivants. Nous avons conçu un vecteur copie haute nombre d&#39;expression utile pour le promoteur et les analyses élément promoteur. Ce vecteur contient le gène de la GFP, qui est utilisé pour visualiser promoteur / fonction élément promoteur dans les tissus transformés. </li><li> Autour de 1-2 h avant le bombardement, les cotylédons accise haricot de Lima de germer les semis et enlever les téguments. Cotylédons adaptée pour le bombardement devrait être jaune à vert pâle, plat et exempt de tout dommage qui pourrait interférer avec l&#39;analyse d&#39;images supplémentaires. </li><li> Cotylédons Placer sur un milieu de culture contenant des sels de SGD MS 1, 2 vitamines B5, 3% de saccharose et de Gelrite 0,2% (pH 5,7) immédiatement après avoir été excisée. </li><li> Précipiter la construction d&#39;ADN sur des particules de tungstène M10 (Sylvania, Towanda, PA, USA). Dans un tube de 0,6 ml de microcentrifugation, ajouter 25 ul particules de tungstène (particules sont remises en suspension dans l&#39;eau stérile, 100 mg ml -1, juste avant l&#39;utilisation), 5 ul d&#39;ADN (1 pl g -1), 25 ul de chlorure de calcium 2,5 M (Sigma Cat-Aldrich. C3881-500G) et 10 pl 100 mM (Sigma Cat. S-2626) spermidine. Vortex brièvement pour bien mélanger tous les composants. </li><li> Incuber la préparation de l&#39;ADN sur la glace pendant 5 min. Ensuite, retirer et jeter le surnageant 50 pi. </li><li> Resuspendre les particules enrobées d&#39;ADN par des vortex et de retirer immédiatement une aliquote de 2 pl. Répétez cette étape de vortex à chaque fois une aliquote est retiré du tube. Particules enrobées doivent être conservés dans la glace et utilisé dans les 15 min. </li><li> Grâce à la partie supérieure d&#39;un filtre à seringue, placer 2 ul particules enrobées dans le milieu de l&#39;écran filtrant. Placez l&#39;unité de filtration contenant des particules enrobées dans l&#39;unité de détention filtre à l&#39;intérieur de la chambre de canon à particules. </li><li> Placer un haricot de Lima cotylédons côté adaxiale sur un baffle et le lieu de la chicane dans la chambre de canon à particules. La chicane, qui se compose d&#39;un écran de fondre au fond d&#39;un bécher, est utilisé comme une plate-forme pour soutenir les tissus pendant le bombardement. </li><li> Bombardez les tissus en utilisant un canon à particules (dans cette méthodologie, nous utilisons un canon à particules simple et peu coûteux d&#39;apports 3, PIG, conçu dans notre laboratoire) comme suit: a) ouvrir la vanne menant à la dépression pour évacuer la chambre, b) après le vide atteint 760 mm (30 po) Hg, activer le solénoïde et la libération de l&#39;hélium pour propulser les particules, c) après le bombardement de particules, fermer le robinet ligne de vide et de relâcher le vide à l&#39;aide de la soupape d&#39;échappement. La pression d&#39;hélium utilisé pour accélérer des particules est de 50 psi. </li><li> Après le vide est libéré, ouvrez la porte de la chambre pour récupérer les cotylédons bombardés et retourner le cotylédon, côté adaxiale place, au milieu de culture SGD. Note: Pour la quantification et le profilage d&#39;expression, nous avons l&#39;habitude bombardent un minimum de trois cotylédons pour chaque construction d&#39;ADN. Un contrôle positif, qui est habituellement un ADNconstruction qui donne un profil bien étudié l&#39;expression des gènes, est compris comme une référence. </li></ol> III. Collection d&#39;images automatique <ol><li> Allumez la lampe au mercure et d&#39;attendre 30 min pour la lampe pour se réchauffer. </li><li> Tournez sur les sources d&#39;alimentation pour la caméra CCD Spot-RT (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, Michigan, USA) et la plate-forme robotique contrôleur de moteur, qui entraîne le mouvement de la plate-forme robotique. </li><li> Régler le jeu de filtres pour la GFP détection (GFP2 ensemble de filtres;.. Ex nm 480/40, Em 510 LP) sur un microscope disséquant MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Suisse). </li><li> Stériliser les couvercles en polycarbonate épaissi boîte de Petri par pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70%. Les couvercles spécialisé, utilisé pour couvrir la base de boîte de Pétri éviter la condensation pendant 4 collection d&#39;images. </li><li> Placez les plaques contenant cotylédons bombardés sur la plateforme robotique (Arrick Robotique, Hurst, TX, USA) du système de collecte automatisée d&#39;images. La plate-forme robotique est piloté par un ensemble moteur pas à pas et se compose d&#39;une table pour la fixation des boîtes de Pétri 8. La plateforme est construite en polycarbonate, polypropylène et aluminium. Les plaques sont fixées en position par serrage en plastique latéraux de vis de fixation. </li><li> Ouvrez l&#39;application logicielle personnalisée qui contrôle à la fois la plate-forme de robotique et d&#39;acquisition d&#39;image. Aussi, ouvrez le logiciel switch blanche contrôleur de la lumière. </li><li> Dans le «mouvement du moteur&quot;, cliquez sur &quot;moteur sur» et «camping». Une fois le logiciel oriente la plate-forme à la position de la maison, nous sommes prêts à commencer à entrer des positions pour chaque cotylédon. </li><li> Dans le «mouvement du moteur&quot;, sélectionnez la première plaque. La plate-forme sera la position du centre de la boîte de Pétri sous l&#39;objectif du microscope. En utilisant les boutons de distance de déplacement, de positionner précisément le cotylédon première collection d&#39;images. Avec le contrôleur de lumière blanche sur la région cible peut être observée à travers l&#39;écran d&#39;ordinateur en activant le mode &quot;live&quot; caractéristique. </li><li> Pour le premier cotylédon, mis l&#39;accent et le grossissement (grossissement 1.6x est préférable) en utilisant les boutons de manuel sur le microscope à dissection. Accent ajustements pour les cotylédons restant sur la même plaque sont faites au moyen de trois vis de réglage située sous chaque assiette, sur la plateforme robotique. </li><li> Une fois la région d&#39;intérêt a été fixé, cliquez sur le lien &quot;ajouter cette position&quot; bouton. Le logiciel va ajouter les coordonnées de cette région à un fichier de planification position et la plate-forme sera de retour au centre de la plaque. </li><li> Régler les positions et se concentrer pour tous les cotylédons restant sur des plaques en utilisant les boutons distance de déplacement et de vis de réglage manuel. Après toutes les coordonnées de tous les cotylédons ont été inscrits, enregistrer les coordonnées calendrier de position. </li><li> Entrez les paramètres de collecte d&#39;images. Dans le &quot;réglage de l&#39;image&quot;, sélectionnez le type de lumière désiré; blanc ou bleu. Pour la détection GFP, seule la lumière bleue devrait être utilisé. Aussi, entrez le paramètre d&#39;exposition. Bien que nous ne pouvons modifier le temps d&#39;exposition indépendamment de la couleur rouge, bleu et vert, nous utilisons habituellement les mêmes paramètres pour la GFP photo-documentation (20, 14 et 14 sec pour le canal rouge, vert et bleu, respectivement) nous permettant de faire des directs et comparaisons cohérentes entre les constructions d&#39;ADN différentes. </li><li> Dans la même «mise en image&quot; onglet, spécifiez un dossier vide dans lequel les images seront stockées. Chaque série d&#39;images seront sauvegardées dans ce dossier principal dans des dossiers indépendants, numérotés séquentiellement selon l&#39;ordre des positions entré pour cotylédons. </li><li> Allez à la &quot;commande en temps de capture&quot; onglet et définissez l&#39;intervalle de temps d&#39;acquisition d&#39;image et le nombre total de cycles de collecte de l&#39;image. Les images sont généralement recueillies toutes les heures pendant 100 h, générant bien définis des profils d&#39;expression génique. </li><li> Démarrer l&#39;acquisition d&#39;images en cliquant sur le &quot;calendrier de courir!&quot; bouton situé dans le «calendrier de la position&quot; onglet. </li><li> A la fin de la collection de 100 images h, le transfert de toutes les images de l&#39;ordinateur contrôlant le robot à tout lecteur dur de grande capacité ou un ordinateur pour l&#39;analyse d&#39;images supplémentaires. Des images haute résolution (1600 x 1200 pixels) sont recueillies dans les fichiers TIF mesure ~ 5 Mo chacune. </li></ol> IV. Image Analysis <ol><li> Assemblez les 100 images séquentielles de chaque dossier à l&#39;aide d&#39;Adobe ImageReady. <ol><li> Ouvrez ImageReady et importer toutes les images séquentielles de composer une série de cadres. </li><li> Redimensionner des images originales à 800 x 600 pixels. Images recueillies sont en haute résolution, ce qui génère des fichiers de grande taille qui peut rendre le traitement d&#39;image lente. </li><li> Faites défiler les images et trouver un endroit (s) visible dans la plupart des images. </li><li> Zoom jusqu&#39;à 300% sur l&#39;endroit sélectionné (s). Alignement des images en utilisant un plus fort grossissement permet un enregistrement plus précis. </li><li> Insérez un calque au-dessus de toutes les images et vérifiez si est visible dans tous les cadres. Marquez l&#39;endroit (s) emplacement à l&#39;aide du «pinceau» de l&#39;outil. </li><li> Commencer à aligner toutes les trames utilisant l&#39;outil «Déplacement» et en prenant les notes sur la couche comme une référence. </li><li> Lorsque l&#39;alignement est terminé, supprimer le calque utilisé comme référence et enregistrer des images en une seule &quot;PSD&quot; fichier. En outre, d&#39;exporter toutes les fenêtres comme une seule &quot;mov&quot; fichier en utilisant la plus haute résolution. Alignement manuel de chaque série d&#39;image prend environ 10 minutes. </li></ol></li><li> Effectuer la quantification de l&#39;expression génique utilisant ImageJ. <ol><li> Ouvrez le logiciel ImageJ et ouvrez le &quot;mov&quot; fichier enregistré précédemment dans ImageReady. </li><li> Utilisation de l&#39;outil de sélection, choisissez une zone de 400 x 300 pixels et recadrer l&#39;image. Ce nouveau fichier doit être enregistré en tant que &quot;avi&quot; de fichiers. </li><li> Séparez les images séquentielles, situé dans le nouveau &quot;avi&quot; de fichiers dans les canaux rouge, vert et bleu en cliquant sur «image», «couleur» et «split RVB&quot; dans ImageJ. </li><li> Soustraire la fluorescence de fond de toutes les images dans les canaux vert et rouge. En utilisant la série d&#39;images de canal vert, sélectionnez une zone de 20 x 20 pixels d&#39;une région avec des non-cellules exprimant et enregistrer son emplacement dans le &quot;Gestionnaire de ROI&quot; outil, de sorte que la même zone seront sélectionnés dans les deux canaux. Avec le carré 20 x 20 pixels actifs dans le canal vert, allez à la &quot;plugins&quot; de commande situé dans la barre des tâches de ImageJ et cliquez ensuite sur le &quot;ROI soustrayez mesurée pour chaque tranche de&quot; plugin-outil. </li><li> En ImageJ, cliquez sur &quot;Image&quot;, &quot;ajuster&quot; puis &quot;seuil&quot; de définir ou d&#39;un segment du exprimant la GFP pixels. Ajuster les niveaux de seuil en faisant glisser la barre dans la fenêtre de seuil pour obtenir une taille de spot moyen de 20-30 pixels. </li><li> Déterminer expression de la GFP en utilisant un plugin que nous avons conçu pour mesurer la valeur de la moyenne en niveaux de gris par pixel et le nombre total de pixels exprimant la GFP. </li><li> Copiez le gris de sortie moyenne des valeurs dans ImageJ et collez-le dans Microsoft Office Excel. Calculer l&#39;expression de GFP pour chaque canal (rouge et vert) en multipliant la moyenne en niveaux de gris par pixel de valeur par le nombre total de pixels exprimant la GFP pour chaque canal. La somme des valeurs d&#39;expression pour les deux canaux donne l&#39;expression de GFP. Les valeurs peuvent être utilisées pour illustrer les profils d&#39;expression génique et de faire des comparaisons directes. Time-lapse animations peuvent aussi être générés en utilisant &quot;mov&quot; ou &quot;AVI&quot; fichiers, offrant une visualisation unique et claire du profil d&#39;expression génique. </li></ol></li></ol> Résultats Représentant V. La collecte et l&#39;analyse d&#39;image robotisée procédure (Fig. 1) rapportés ici permet l&#39;acquisition d&#39;une grande quantité de données quantitatives sur l&#39;expression génique dans un court laps de temps. Pour la caractérisation promoteur végétal en utilisant le gène de la GFP, cette méthodologie n&#39;est pas seulement utile pour créer des profils d&#39;expression transitoire (Fig. 2), mais aussi de suivre dans une expression de la GFP-détaillée manière transitoire et les tissus végétaux stablement transformées 5,6. Court time-lapse animations générées avec les images recueillies séquentielle sont un outil précieux pour une analyse en profondeur de l&#39;expression génique au cours du temps dans les tissus végétaux. Cette méthodologie a aussi une grande application pour évaluer les facteurs qui affectent directement l&#39;expression des gènes. Par exemple, expression de la GFP transitoires sous la présence de différents suppresseurs de faire taire d&#39;origine virale a été correctement étudiés à l&#39;aide de notre collection d&#39;images automatisée et 7,8 système d&#39;analyse. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Procédure d&#39;analyse d&#39;image se compose de quatre étapes principales. (A) Acquisition de séries d&#39;images en utilisant le système robotique d&#39;image de collecte, (B) la séparation des images dans les canaux rouge, vert et bleu, (C) la segmentation des pixels exprimer en ajustant les niveaux de seuil, et (D) l&#39;obtention des résultats de sortie contenant les valeurs de gris et les exprimant la GFP compter de discussion. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Graphique montrant différents profils d&#39;expression transitoire tirée par les promoteurs végétaux fusionnée à la GFP. Les données ont été recueillies à l&#39;aide de notre système robotique collection d&#39;images et analysées avec le logiciel ImageReady et ImageJ.

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

L&#39;utilisation de la robotique a des applications considérables dans différents aspects de la vie humaine, plus précisément, les robots ont été effectivement utilisés pour effectuer des activités dans des environnements dangereux, à automatiser les activités fastidieuses et complexes, et pour effectuer des tâches d&#39;une manière plus précise. En biologie moléculaire, et en particulier des analyses d&#39;expression génique, les robots peuvent aider à suivre non seulement les caractéristiques des gènes, mais aussi la croissance des tissus et le développement au fil du temps. De nombreux phénomènes biologiques se produisent de façon dynamique, ce qui peut être difficile à suivre à l&#39;aide seule des observations ponctuelles temps. L&#39;utilisation du gène de la GFP pour les études d&#39;expression apporte des avantages supplémentaires pour l&#39;observation de la réponse des tissus et la croissance. Pour nos procédures expérimentales, la GFP permet de suivre l&#39;expression des gènes dans le même morceau de tissu au fil du temps que la détection de la GFP est une méthode non destructive. En outre, notre version de la protéine GFP est suffisamment stable pour permettre la détection, mais montre aussi une certaine rotation afin de minimiser l&#39;accumulation dans les tissus végétaux, nous permettant de suivre à la fois la montée et la chute de l&#39;expression génique. Nous avons déjà utilisé notre collection d&#39;images de robotique et système d&#39;analyse d&#39;un large éventail d&#39;applications. Nous prévoyons un fort potentiel pour de nombreuses applications biologiques où une compréhension dynamique d&#39;un phénomène est souhaitée. Par exemple, la croissance et le développement des tissus de la plante peuvent être suivis en utilisant notre système donnant de précieux renseignements / informations sur ces processus. En outre, la dynamique du transport des protéines en utilisant des gènes rapporteurs comme la GFP, peuvent être facilement visualisés à l&#39;aide time-lapse animations. La méthodologie décrite dans le présent rapport est techniquement complexe, mais conceptuellement simple. Nos résultats sont robustes et de nouvelles applications sont continuellement découvertes.

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
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		</table>
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robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

L&#39;expression des gènes dans les tissus végétaux est généralement étudiée par extraction des composés destructeurs de tissus végétaux pour le<em&gt; In vitro</em&gt; Analyses. Les méthodes présentées ici utilisent la protéine fluorescente verte (<em&gt; Gfp</em&gt;) Gène pour une surveillance continue de l&#39;expression génique dans les mêmes pièces de tissus, au fil du temps. L&#39;<em&gt; Gfp</emGénique&gt; a été placé sous contrôle réglementaire des différents promoteurs et introduits dans les tissus de haricots de lima cotylédonaire via un bombardement de particules. Cotylédons ont ensuite été placés sur un système de collection d&#39;images robotiques, qui se composait d&#39;un microscope à fluorescence disséquant avec un appareil photo numérique et une plate-forme 2-dimensionnelle de la robotique conçu sur mesure pour permettre une fixation sûre du boîtes de culture. Les images ont été recueillies à partir des tissus cotylédonaires toutes les heures pour 100 heures de générer des profils d&#39;expression pour chaque promoteur. Chaque série de 100 images collectées a été d&#39;abord soumis à l&#39;alignement d&#39;image manuel à l&#39;aide d&#39;ImageReady pour s&#39;assurer que exprimant la GFP foyers étaient toujours retenus dans des domaines choisis de l&#39;analyse. Des régions spécifiques de la série de mesure 300 x 400 pixels, ont ensuite été sélectionnés pour une analyse plus poussée pour fournir des mesures d&#39;intensité GFP en utilisant le logiciel ImageJ. Des images par lots ont été séparés dans les canaux rouge, vert et bleu et exprimant la GFP domaines ont été identifiés en utilisant la fonction seuil de ImageJ. Après soustraction de la fluorescence de fond (soustraction des valeurs de gris de la non-expression de pixels de chaque pixel) dans les canaux respectifs rouge et vert, l&#39;intensité GFP a été calculée en multipliant la moyenne en niveaux de gris par pixel de valeur par le nombre total de pixels exprimant la GFP dans chaque canal, puis en ajoutant ces valeurs à la fois pour les canaux rouge et vert. Les valeurs d&#39;intensité GFP ont été recueillies pour tous les 100 points de temps pour obtenir des profils d&#39;expression. Les variations dans les profils d&#39;expression de GFP a entraîné des différences dans des facteurs tels que la force du promoteur, la présence d&#39;un suppresseur de silencing, ou la nature du promoteur. En plus de la quantification de l&#39;intensité de la GFP, les séries d&#39;images ont également été utilisés pour générer des time-lapse animations en utilisant ImageReady. Time-lapse animations ont révélé que la grande majorité des cellules affiché une augmentation relativement rapide dans l&#39;expression de la GFP, suivie par un lent déclin. Certaines cellules occasionnellement affiché une perte soudaine de la fluorescence, qui peut être associée à une mort cellulaire rapide. Transports apparente de la GFP à travers la membrane et la paroi de la cellule aux cellules adjacentes a également été observée. Laps de temps des animations fourni des informations supplémentaires qui ne pourraient être obtenus en utilisant des profils d&#39;intensité GFP ou simples collections temps du point de l&#39;image.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Nous rapportons une méthode pour l&#39;introduction, le suivi et l&#39;analyse quantitative de l&#39;expression de GFP dans les cellules végétales. Cette méthode utilise un système conçu sur mesure pour la robotique collection d&#39;images en semi-continu d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, au fil du temps. Nous démontrons également l&#39;utilisation d&#39;ImageJ et ImageReady pour l&#39;analyse des séries d&#39;images.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  The Ohio State University. Nous rapportons une méthode pour l'introduction, le suivi et l'analyse quantitative de l'expression de GFP dans les cellules végétales. Cette méthode utilise un système conçu sur mesure pour la robotique collection d'images en semi-continu d'un grand nombre d'échantillons, au fil du temps. Nous démontrons également l'utilisation d'ImageJ et ImageReady pour l'analyse des séries d'images.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...